miR-135b和LZTS1 mRNA HE4 mRNA在卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義

章 品，馮國琴，程文鳳，章 陽

(1.湖北省老河口市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 老河口 441800 2.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院/湖北省襄陽市中心醫(yī)院腫瘤科，湖北 襄 陽 441021)

卵巢癌是一種常見的女性生殖器惡性腫瘤，由于早期缺乏典型癥狀及有效篩查手段，多數(shù)卵巢癌患者就診時已屬Ⅲ期、Ⅳ期，5年生存率低至30%[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)作為一類可調(diào)控基因表達(dá)的RNA小分子，參與并影響多種腫瘤發(fā)展過程，是診治及評估腫瘤預(yù)后的潛在生物學(xué)指標(biāo)[2]。汪萍萍等[3]研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-135b(miR-135b)在卵巢上皮癌中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，miR-135b可能在卵巢上皮癌中發(fā)揮促癌作用。亮氨酸拉鏈腫瘤抑制基因1(LZTS1)是一種潛在抑癌基因，其在肝細(xì)胞癌中可通過損害磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路發(fā)揮抑癌作用，LZTS1有望成為肝細(xì)胞癌的診治靶標(biāo)[4]。人附睪蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)在正常組織中含量較低，但其在卵巢癌中表達(dá)升高，有利于卵巢癌的診斷和預(yù)后評估[5]。但miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA聯(lián)合診斷卵巢癌的研究尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道。基于此，本研究通過初步觀察miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA在卵巢癌中的表達(dá)情況，旨在探究miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA對卵巢癌的診斷效能。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2018年1月至2020年11月本院接收的卵巢癌患者56例，收集手術(shù)切除的卵巢癌組織標(biāo)本(卵巢癌組)及對應(yīng)癌旁組織(癌旁組)進(jìn)行研究。其中年齡38～65歲，平均年齡(50.09±10.32)歲，<50歲18例，≥50歲38例；漿液性囊腺癌39例，黏液性腺癌17例；低、中分化40例，高分化16例；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期34例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《卵巢癌診療規(guī)范(2018年版)》中的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行診斷[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)手術(shù)病理組織確診為卵巢癌；②患者為首次就診；③術(shù)前未接受放療、化療或其它輔助治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷不明確、病歷資料不全者；②合并其他類型腫瘤者；③合并免疫功能缺陷、結(jié)締組織疾病、嚴(yán)重心肝腎功能不全者。所有患者自愿參與本項研究。本研究獲得本院倫理委員會審核、批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器:TRIzol試劑(貨號：15596-025)購自上海偉進(jìn)生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：XY-411A)購自上海信裕生物科技有限公司，熒光定量PCR試劑盒(2×SYBR Green qPCR Master Mix)(貨號：N/A-632)購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司。紫外分光光度計(型號：NanoDrop One/One c)購自北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(型號：MiniAmp)購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.3方 法

1.3.1標(biāo)本采集:行手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本迅速置于液氮罐中，一段時間后，放入-80℃冰箱中凍存。

1.3.2qRT-PCR法檢測miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA水平:取出-80℃冰箱中保存的組織標(biāo)本，研磨，采用TRIzol法抽提組織標(biāo)本的總RNA，以紫外分光光度計測定抽提RNA在波長260nm、280nm的吸光度(A)，以A260/A280比值在1.8～2.0之間的標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)實驗。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照2×SYBR Green qPCR Master Mix配制相應(yīng)反應(yīng)體系，將cDNA進(jìn)行擴(kuò)增、檢測。miR-135b以U6為內(nèi)參，LZTS1 mRNA、HE4 mRNA以GAPDH為內(nèi)參，引物由華大公司合成，對應(yīng)引物序列見表1，miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA的表達(dá)水平以2-△△CT法計算。

表1 miR-135b LZTS1 mRNA HE4 mRNA及對應(yīng)內(nèi)參U6 GAPDH的引物序列

2 結(jié) 果

2.1癌旁組和卵巢癌組miR-135b、LZTS1 mRNA及HE4 mRNA表達(dá)水平比較:卵巢癌組miR-135b、HE4 mRNA表達(dá)水平均明顯高于癌旁組(P均<0.05)，LZTS1 mRNA表達(dá)水平明顯低于癌旁組(P<0.05)。見表2。

表2 癌旁組和卵巢癌組miR-135b LZTS1 mRNA及HE4 mRNA表達(dá)水平比較

2.2卵巢癌組織中miR-135b表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系:以卵巢癌組織中miR-135b表達(dá)水平均值1.65為界限，其中miR-135b表達(dá)水平低于1.65的患者為miR-135b低表達(dá)組(n=22)，高于1.65的患者為miR-135b高表達(dá)組(n=34)。結(jié)果顯示，卵巢癌組織中miR-135b表達(dá)水平與年齡、病理類型無關(guān)(P均>0.05)，與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)。見表3。

表3 卵巢癌組癌組織中miR-135b表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系n(%)

2.3卵巢癌組織中LZTS1 mRNA表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系:以卵巢癌組織中LZTS1 mRNA表達(dá)水平均值0.72為界限，其中LZTS1 mRNA表達(dá)水平低于0.72的患者為LZTS1 mRNA低表達(dá)組(n=29)，高于0.72的患者為LZTS1 mRNA高表達(dá)組(n=27)。結(jié)果顯示，卵巢癌組織中LZTS1 mRNA表達(dá)水平與年齡、病理類型無關(guān)(P均>0.05)，與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)。見表4。

表4 卵巢癌組癌組織中LZTS1 mRNA表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系n(%)

2.4卵巢癌組織中HE4 mRNA表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系:以卵巢癌組織中HE4 mRNA表達(dá)水平均值1.57為界限，其中HE4 mRNA表達(dá)水平低于1.57的患者為HE4 mRNA低表達(dá)組(n=24)，高于1.57的患者為HE4 mRNA高表達(dá)組(n=32)。結(jié)果顯示，卵巢癌組織中HE4 mRNA表達(dá)水平與年齡、病理類型無關(guān)(P均>0.05)，與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)。見表5。

表5 卵巢癌組癌組織中HE4 mRNA表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系n(%)

圖1 miR-135b、LZTS1 mRNA及HE4 mRNA表達(dá)水平對卵巢癌的診斷價值

2.5miR-135b、LZTS1 mRNA及HE4 mRNA表達(dá)水平對卵巢癌的診斷價值:miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA對卵巢癌診斷的曲線下面積(AUC)分別為0.781(95%CI：0.693～0.869)、0.755(95%CI：0.665～0.844)、0.773(95%CI：0.685～0.862)，靈敏度分別為74.5%、76.4%、72.7%，特異度分別為77.2%、72.9%、77.2%，截斷值分別為1.25、0.87、1.20；三者聯(lián)合對卵巢癌診斷的AUC為0.943(95%CI：0.904～0.982)，其靈敏度、特異度分別為90.9%、84.2%。見圖1。

3 討 論

卵巢癌是女性惡性腫瘤之一，位于盆腔深部，多數(shù)患者早期無明顯癥狀，易引起漏診，嚴(yán)重影響女性患者生存情況[7]。因此，尋找可有效診斷卵巢癌的手段，對改善患者預(yù)后具有積極意義。

miRNA參與并調(diào)控細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程，與卵巢癌等多種腫瘤關(guān)系密切[8]。已有研究表明miR-135b在子宮內(nèi)膜癌中呈高表達(dá)，其可通過下調(diào)靶基因叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族1(FOXO1)，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展[9]。Lv等[10]也報道m(xù)iR-135b在乳腺癌中過表達(dá)，通過直接靶向大腫瘤抑制激酶2而調(diào)控Hippo信號，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的形成與發(fā)展。以上研究表明，miR-135b在兩種女性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其有望作為監(jiān)測兩種女性惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)分子指標(biāo)。本研究顯示，卵巢癌組miR-135b表達(dá)水平明顯高于癌旁組，提示miR-135b可能與卵巢癌發(fā)展過程有關(guān)。分析其可能原因，miR-135b通過作用于特定靶基因進(jìn)而調(diào)控信號傳導(dǎo)，從而影響卵巢癌的發(fā)展進(jìn)程。

LZTS1 mRNA在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)， 其可能在許多腫瘤形成及發(fā)展過程中起重要作用[11]。有關(guān)研究顯示，LZTS1 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌臨床Ⅰ、Ⅱ期的異常表達(dá)率明顯高于Ⅲ、Ⅳ期，LZTS1 mRNA異常表達(dá)可能與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，其對診斷甲狀腺乳頭狀癌有一定輔助作用[12]。此外，Olasz等[13]發(fā)現(xiàn)LZTS1 mRNA在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中異常下調(diào)，LZTS1 mRNA受miR-135b負(fù)調(diào)控，其可能影響皮膚鱗狀細(xì)胞癌病變過程。本研究顯示，卵巢癌組LZTS1 mRNA表達(dá)水平明顯低于癌旁組，與其在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的趨勢一致[13]，提示LZTS1 mRNA可能在卵巢癌形成發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮一定作用，其具有診斷卵巢癌的潛在價值，推測LZTS1 mRNA通過受靶基因miRNA調(diào)控，進(jìn)而在卵巢癌發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮抑癌作用。

HE4 mRNA在天然免疫、精子成熟及腫瘤增殖過程中發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)功能[14]。研究發(fā)現(xiàn)，HE4 mRNA在上皮性卵巢癌中呈高表達(dá)，其與上皮性卵巢癌患者預(yù)后相關(guān)，可輔助診斷上皮性卵巢癌[15]。本研究顯示卵巢癌組HE4 mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁組，與Luo等[15]研究趨勢相符，提示HE4 mRNA可能參與并影響卵巢癌發(fā)展過程。HE4 mRNA可能在卵巢癌發(fā)展病程中發(fā)揮促癌作用。

此外，本研究顯示，卵巢癌組織中miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，進(jìn)一步提示miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA與卵巢癌病情進(jìn)展相關(guān)，三者可能在卵巢癌進(jìn)展中發(fā)揮促癌或抑癌作用。本研究還探討了卵巢組織miR-135b、LZTS1 mRNA及HE4 mRNA表達(dá)水平對卵巢癌的診斷價值，結(jié)果顯示，卵巢組織miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA診斷卵巢癌的AUC分別為0.781、0.755、0.773，當(dāng)卵巢組織miR-135b表達(dá)水平高于1.25或LZTS1 mRNA表達(dá)水平低于0.87或HE4 mRNA表達(dá)水平高于1.20，卵巢癌發(fā)生率增高，提示miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA對診斷卵巢癌具有一定潛在價值；卵巢組織miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA聯(lián)合診斷卵巢癌的價值高于單獨(dú)檢測價值，三者聯(lián)合可有效提高卵巢癌的診斷效能。

綜上所述，卵巢癌患者癌組織中miR-135b、HE4 mRNA表達(dá)上調(diào)，LZTS1 mRNA表達(dá)下調(diào)，三者均可能參與并影響卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程，可有效提高預(yù)測卵巢癌的價值，具有篩選卵巢癌的輔助作用。