扁桃斑鳩菊葉酵素發酵過程中理化性質分析、抗氧化能力評價及對氧化應激細胞防護作用研究

鄭文豪，王珍珍，李 江，司 奇，季紅福，葉春林, ，戴 靜，沙如意，毛建衛,2,

（1.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江杭州 310023；2.浙江工業職業技術學院，浙江紹興 312000）

扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalinaDel.），菊科斑鳩菊屬，稱非洲樹，又因其味苦，還被稱為苦葉，是一種生長在非洲等熱帶地區及濕度較大地區的小喬木[1]，最早在非洲發現，在潮濕環境生長旺盛，能耐高溫天氣，四季可種植，在非洲民間被視為一種藥用植物，后從國外移植到我國。扁桃斑鳩菊氣味苦澀，性涼，具有抗氧化[2?4]、抑菌[4?5]、抗腫瘤[5]、治潰瘍[6]、調節血糖、降血脂、抗炎[7]、殺蟲[8]、抗瘧[9]等活性。目前，扁桃斑鳩菊的研究主要以提取工藝優化及功能評價為主，測定提取物功能成分含量及其功效研究。而扁桃斑鳩菊的酵素產品尚且不多，其功能成分檢測及功效評價的關注度也很低。但酵素產業的迅速發展，為扁桃斑鳩菊的合理開發利用提供了新的途徑與前景。

食用植物酵素（Edible plant Jiaosu）是以可食用果蔬等植物為原料，適當添加輔料，經微生物在一定條件下發酵制得的一種富含小分子活性物質的酵素產品，能極大的富集原料內的活性成分，并通過微生物作用生成一系列代謝產物[10?11]。扁桃斑鳩菊作為一種可食用植物，本文以其葉為原料，添加白砂糖為碳源制備扁桃斑鳩菊葉植物酵素，置于（25±2.5） ℃條件下避光發酵，監測發酵過程中總酸、pH、可溶性蛋白質、總糖、總黃酮、總酚、抗壞血酸等理化指標和抗氧化能力的變化，并評價其對肝細胞氧化應激保護作用，以期建立一種扁桃斑鳩菊葉酵素評價方法，為其工業化發酵和在食品及藥品工業行的應用開發提供一定的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

扁桃斑鳩菊葉 葉齡2個月，2020年6月采自浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室植物園；考馬斯亮藍-G250、牛血清白蛋白、10%福林酚（v/v）、碳酸鈉、硫酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸硫酸亞鐵、水楊酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸、抗壞血酸 上海阿拉丁化學試劑有限公司；WRL-68人正常肝細胞 由浙江大學醫學院附屬第一醫院提供；DMEM高糖培養基、青霉素-鏈霉素（100×）、磷酸緩沖液（PBS）、特級胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶溶液 武漢普諾賽生命科技有限公司；T25培養瓶 美國康寧公司（Corning）；總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；3-（4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍（MTT）及其他試劑盒 碧云天生物技術有限公司。

SpectraMax iD5多功能微孔讀板酶標儀 美國Molecular Devices公司；Allegra X-12R離心機 貝克曼庫爾特有限公司；PB-10酸度計 德國賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；生物安全柜 美國Thermo Scientific。

1.2 實驗方法

1.2.1 扁桃斑鳩菊葉含水量測定及水提物、酵素的制備 用滅菌水洗凈新鮮扁桃斑鳩菊葉，晾干表面水分，切成片狀（約1 cm×1 cm），按扁桃斑鳩菊葉:糖:無菌水=1:1:3（w:w:w）比例加至10 L發酵罐中，在（25±2.5）℃條下進行暗發酵。定期取樣（2、4、

6、8、10、12、14、16、18、20、24、28、34、44、54 d），10000 r/min離心20 min，取上清液備用；取50 g洗凈、晾干后葉片，稱重后置于水分測定儀內，測定水分含量，重復測定三次；取洗凈、晾干后葉片，在105 ℃烘至恒重，粉碎過篩（60目），按新鮮扁桃斑鳩菊葉質量:水=1:3（w:w），功率100%、40 ℃提取2 h，得到水提物。

1.2.2 理化指標的測定

1.2.2.1 pH測定 依據GB 10468-1989《水果和蔬菜產品pH值的測定方法》測定pH[12]。

1.2.2.2 總酸含量測定 依據GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》測定可滴定酸的含量，測定結果以乳酸（g/100 mL）計[13?14]。

1.2.2.3 總糖含量測定 采用苯酚-硫酸法[15]，樣品稀釋10倍，取1.0 mL，加入0.5 mL 6%苯酚溶液，混勻，加入2.5 mL濃硫酸，混勻，沸水浴反應15 min，待冷卻至室溫后于波長490 nm處測定吸光度。用葡萄糖標準品溶液繪制標準曲線，得到回歸方程后計算葡萄糖含量及相對標準偏差。

1.2.2.4 可溶性蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍法[16]，取適量樣品，補去離子水至1 mL，加0.1 mg/mL考馬斯亮藍-G250溶液5 mL，室溫反應10 min，在595 nm測吸光度。以牛血清白蛋白標準品繪制標準曲線，得到回歸方程后計算可溶性蛋白質含量及相對標準偏差。

1.2.2.5 總酚含量測定 采用福林酚法[17]，將不同發酵時間的酵素稀釋10倍，分別取0.5 mL，加入2.5 mL 10%（v/v）福林酚溶液，避光反應3 min，加入2 mL 7.5%（w/v）Na2CO3水溶液，避光反應1 h，去離子水做空白調零，在波長765 nm處測定吸光度值。以沒食子酸標準品溶液繪制標準曲線，得到回歸方程后計算總酚含量及相對標準偏差。

1.2.2.6 總黃酮含量測定 采用氯化鋁法[18]，取不同發酵時間的酵素樣品400 μL，加入0.15 mL質量分數為5%的亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min，加入0.15 mL質量分數10%的氯化鋁溶液，混勻，靜置6 min，加入1.0 mL質量分數4%的氫氧化鈉溶液，補去離子水至總體積為5 mL，混勻后室溫靜置15 min，于波長510 nm處測定吸光度值。以蘆丁標準品溶液繪制標準曲線，得到回歸方程，計算總酚含量及相對標準偏差。

1.2.2.7 抗壞血酸含量測定 抗壞血酸標準曲線的繪制：分別取0.1 mg/mL抗壞血酸標準液0、50、100、150、200、250、300、400、500 μL，用0.1%鹽酸溶液定溶至5 mL，于243 nm測吸光值，以標準液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。酵素樣品處理：a.酸處理：取100 μL酵素，加入200 μL 10%鹽酸溶液，去離子水定容至5 mL，243 nm測吸光值；b.堿處理：取100 μL酵素，加400 μL 1 mol/L 氫氧化鈉溶液，加入1 mL去離子水，靜置20 min，加入400 μL 10%鹽酸溶液，定容至5 mL，243 nm測吸光值；酸、堿處的吸光度差值即為酵素樣品的吸光度值，代入標準曲線，計算VC含量[19]。

1.2.3 抗氧化能力 羥基自由基清除能力：取不同發酵時間且稀釋10倍的酵素樣品各200 μL，加入140 μL 6 mmol/L H2O2，60 μL 20 mmol/L水楊酸鈉及200 μL 1.5 mmol/L硫酸亞鐵，震蕩混勻，37 ℃反應1 h，于波長510 nm處測定吸光度值。ABTS+自由基清除能力：用5 mmol/L的pH7.4的PBS緩沖液配制7 mmol/L的ABTS溶液，再加入過硫酸鉀使其終濃度為2.455 mmol/L，避光放置12 h，制成ABTS儲備液。臨用前，用PBS緩沖液稀釋將其稀釋至734 nm處吸光度值為（0.70±0.02），制成ABTS工作液。取不同發酵時間且稀釋10倍的酵素樣品各100 μL，加PBS緩沖液200 μL，加5 mL ABTS工作液，30 ℃反應1 h，于波長734 nm處測定吸光度值[20]。

式中：A0為去離子水參比管吸光度值；A1為樣品管吸光度值；A2為樣品本底管吸光度值。

式中：A0為去離子水參比管吸光度值；A1為樣品管吸光度值；A2為樣品本底管吸光度值。

1.2.4 氧化應激保護作用

1.2.4.1 細胞培養 WRL-68細胞用含1%青霉素-鏈霉素、10% FBS的DMEM高糖培養基培養于T25培養瓶，當細胞鋪滿培養瓶底層70%~80%進行傳代，穩定傳代3次后進行實驗。

1.2.4.2 細胞毒性測定 取WRL-68細胞（細胞密度為1×105cells/mL）于96孔培養板，每孔接種100 μL，37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養48 h，加入不同稀釋倍數的扁桃斑鳩菊葉酵素樣品（稀釋10、20、40、60、80倍，過0.22 μm濾膜）及VC（0.25、0.5、1、1.5、2 mg/mL）100 μL，孵育24 h。通過MTT法測定存活率[21]。

1.2.4.3 氧化應激模型建立 取WRL-68細胞（細胞密度為1×105cells/mL）于96孔培養板，每孔接種100 μL，37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養48 h，每孔加入不同濃度的H2O2（400、600、800、1000、1200 μmol/L）100 μL，孵育8 h，建立氧化損傷型WRL-68細胞模型。

1.2.4.4 扁桃斑鳩菊葉酵素對H2O2誘導的WRL-68細胞存活率影響 取WRL-68細胞（細胞密度為1×105cells/mL）置于96孔板，每孔100 μL。培養24 h后去除培養基，樣品組每孔加入樣品（稀釋20、40、60、80倍，過0.22 μm濾膜）100 μL，陽性對照組加入0.25 mg/mL VC100 μL，處理24 h，再利用800 μmol/L的H2O2處理8 h，通過MTT法測定存活率。

1.2.4.5 扁桃斑鳩菊葉酵素對H2O2誘導的WRL-68細胞內ROS水平及抗氧化酶系影響 參照Huang等[22]的測定方法，并略作修改。取WRL-68細胞（細胞密度為1×105cells/mL）于24孔板中，每孔1 mL，培養24 h。每孔加入樣品（稀釋20、40、60、80倍，過0.22 μm濾膜）1 mL處理24 h，再利用800 μmol/L的H2O2處理8 h，每孔加入1 mL 10 μmol/L 2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽活性氧探針（DCFH-DA），37 ℃避光孵育30 min，用無血清細胞培養基洗三次，加1 mL PBS緩沖液，用熒光酶標儀測定細胞內ROS水平；每孔加入樣品（稀釋20、40、60、80倍，過0.22 μm濾膜）1 mL處理24 h，再利用800 μmol/L的H2O2處理8 h，收集細胞上清液，用試劑盒測定SOD、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH）酶活力，并根據BCA檢測試劑盒測定胞內蛋白質含量。

1.3 數據處理

所有試驗均進行3次重復，結果表示為平均值±標準偏差（Mean±SD），采用Origin Pro 8.6對結果進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 扁桃斑鳩菊葉水分含量及酵素發酵過程中總酸含量和pH變化

經測得葉中水分含量為78.72%±0.29%，水提物的pH為5.84，總酸含量為31.25±0.33 μg/mL。發酵過程中總酸及pH變化見圖1，由圖1可知，發酵過程中總酸含量先從0.14±0.01 mg/mL急劇增加至0.58±0.02 mg/mL，再緩慢增加至趨于穩定。pH呈先快速降低，然后緩慢波動的趨勢。發酵4 d，總酸含量急劇增加，pH極顯著下降至3.5（P<0.01），可能因發酵過程中乳酸菌為優勢微生物群，在發酵初期快速生長，蘋果酸、檸檬酸進一步代謝產生乙酸、乳酸等有機酸，使整個發酵環境條件的pH下降[23?24]；還可能因為發酵初期，扁桃斑鳩菊葉細胞在高滲透壓情況下，細胞破裂，胞內有機酸滲出[25]，且復雜的微生物系統，加速了酸性物質的代謝產生。發酵至第10 d，pH呈現出上下波動狀態，基本趨于穩定。總酸含量在第4~28 d呈波動上升趨勢，后趨于穩定，發酵第55 d總酸含量達到最大值，為0.95±0.01 mg/mL。

圖 1 發酵過程中pH和總酸含量的變化Fig.1 Changes of pH and total acid during fermentation

2.2 扁桃斑鳩菊葉酵素發酵過程中總糖含量的變化

總糖包含還原性糖及可水解為還原性單糖的總量，其含量決定著酵素的組織、質量形態及營養價值。葡萄糖回歸方程為y=4.3014x+0.0165，R2=0.9998。總糖含量變化如圖2所示，發酵第2~8 d總糖含量逐漸下降，最大值在第2 d，為244.95±4.89 mg/mL，第8~10 d含量急劇下降。Yang[18]與Otegbayo[26]等研究結果與本文一致，隨著發酵時間的延長，總糖含量總體呈現下降趨勢，扁桃斑鳩菊葉酵素發酵第8~10 d時，pH低至3.43，此時總糖含量的急速下降，可能因乳酸菌的大量增殖導致蔗糖的利用率增加，而乳酸菌的劇增會進一步代謝酸性有機酸的生成，特別是乳酸，會影響發酵液的酸堿度，較酸環境則又會抑制乳酸菌的生長，導致蔗糖利用量降低，表現為發酵整體過程中總糖含量呈現緩慢下降趨勢。葉水提物總糖含量測定為50.69±0.42 mg/mL，酵素發酵過程添加了糖，所以發酵初期酵素總糖含量較高，發酵時間的延長總糖含量降低，最終含量略低于水提物。

圖 2 發酵過程中總糖含量的變化Fig.2 Changes of contents of total sugar during fermentation

2.3 扁桃斑鳩菊葉酵素發酵過程中可溶性蛋白質含量的變化

蛋白質是人體組成成分的基礎物質，評價食物中蛋白質營養價值是食物營養學最基本的內容。由圖3可知，發酵初期，可溶性蛋白質含量上升，第4 d達到最大值，為1.01±0.02 mg/mL，而葉水提物蛋白質含量測得為0.24±0.02 mg/mL，經發酵蛋白含量提高了320.83%。陳燕飛[27]指出，微生物在低滲透壓食品中容易生長，在高滲透壓下易于脫水死亡，只有少數微生物可耐受高滲透壓環境。發酵前期，高滲透壓抑制大多數菌種生長和代謝，原料本身含有的蛋白質可能經過擴散作用釋放到發酵液中，使得可溶性蛋白質含量略微上升。4~6 d可溶性蛋白質含量快速下降至0.84±0.02 mg/mL，可能是被酵母代謝形成氨基酸或脂肪酸，或發酵過程中pH的改變會促進蛋白質的降解[28]。發酵6~12 d開始，可溶性蛋白質含量動態穩定。此時發酵液中碳源充足且原料本身含營養物質，微生物適應環境，蛋白質的生成與代謝處于一個平衡時期，表現為穩定的蛋白質含量。隨著發酵時間的延長，總糖含量趨于穩定，微生物生長繁殖速率降低，體系蛋白質趨于穩定[29]。

圖 3 發酵過程中可溶性蛋白質含量的變化Fig.3 Changes of soluble protein content during fermentation

2.4 扁桃斑鳩菊葉酵素發酵過程中總酚及總黃酮含量的變化

實驗測得扁桃斑鳩菊葉水提物中總酚及總黃酮含量分別為1.14±0.02和0.70±0.02 mg/mL，與水提物相比，適當時間的發酵可以提高總酚含量，但是總黃酮含量降低。酵素發酵過程中總酚和總黃酮含量變換見圖4，發酵至第6 d，總酚含量達到最大，為6.21±0.05 mg/mL，隨后開始下降。發酵后期的總酚含量下降，可能因為可水解的單寧在水解過程中分解為沒食子酸和葡萄糖或鞣花酸和葡萄糖，隨著發酵的進行，微生物代謝和酶活性的增強，部分酚類代謝物最終被分解為酸[30]。發酵第2 d，總黃酮的含量為0.37±0.04 mg/mL，隨著發酵時間的延長，總黃酮含量呈先下降后趨于穩定的趨勢。發酵過程中總酚和總黃酮含量的降低與植物細胞內的多酚氧化酶密切相關，如酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶、漆酶，能夠特異性催化多種酚類物質氧化，從而使發酵過程中總酚和總黃酮的含量降低[31]。原料特性差異，總酚、總黃酮含量隨發酵含量變化也有差異，比如紅豆越橘發酵過程中，二者含量同呈下降趨勢[32]，藍莓酒發酵過程中，都呈現先上升后下降的趨勢[33]。

圖 4 發酵過程中總酚、總黃酮含量的變化Fig.4 Changes of total phenolic and total flavonoid content during fermentation

2.5 扁桃斑鳩菊葉酵素發酵過程中抗壞血酸含量的變化

抗壞血酸又稱VC，富集于新鮮果蔬中，具有重要的抗氧化作用，是免疫系統重要的功能物質，也是營養學指標之一[34]。測得水提物中VC含量為2.00±0.01 μg/mL，酵素中VC含量如圖5所示。酵素發酵前28 d VC含量緩慢增加，第28 d達到最大值，含量為28.44±0.31 μg/mL，隨著發酵的繼續，VC含量下降。田木星等[35]在發酵慕薩萊思酒過程中，同樣發現VC含量先上升后下降。VC含量的上升可能與細胞內容物的溶出及微生物代謝有關。VC含量下降，可能與酵素制備、儲存過程中溫度、氧氣、發酵時間等因素有關[26,35]。

圖 5 發酵過程中抗壞血酸含量的變化Fig.5 Changes of ascorbic acid content during fermentation

2.6 扁桃斑鳩菊葉酵素發酵過程抗氧化能力變化

自由基的存在可能會破壞細胞膜，損傷基因致使細胞變異，導致機體產生各種不適癥狀和疾病。而抗氧化劑具有清除自由基作用，是對人體有益的物質。葉水提物在相同取樣量下，對于羥基自由基和ABTS+自由基清除能力分別為28.97%±1.31%和82.55%±1.77%。扁桃斑鳩菊葉酵素樣品在發酵過程中抗氧化能力變化如圖6所示，隨著發酵時間的延長，羥基自由基清除能力總體呈上升趨勢，第28 d清除能力達到最大，為54.14%±0.43%。發酵第2~28 d，酵素對ABTS+自由基清除能力總體呈現上升趨勢，在2 d時清除能力最低，為51.26%±0.94%。第14 d時最高，為73.72%±0.86%。從18 d開始，清除ABTS+自由基的能力逐步下降，最低達45.46%±0.86%。研究表明：適當時間的發酵，不僅會產生乳酸影響食品的味道和風味，而且還可能將植物胞內水溶性的生物活性化合物釋放到發酵液中，增強原料的抗氧化活性[36]。此外也有研究表明抗氧化能力的強弱往往與生物活性物質之間存在濃度依賴關系[37]。

圖 6 發酵過程中抗氧化能力的變化Fig.6 Changes of antioxidant capacity during fermentation

2.7 發酵過程中抗氧化能力與代謝產物相關性分析

在發酵制備扁桃斑鳩菊酵素的過程中，發酵液具有較高的羥基自由基及ABTS+自由基清除能力，這可能與酵素中的總酸、總酚、總黃酮、抗壞血酸等代謝產物共同作用有關。扁桃斑鳩菊葉酵素發酵過程中理化指標經標準化處理后，利用Pearson法進行相關性分析，結果如表1所示，從表1中可以看出，總酸與羥基自由基清除能力呈極顯著正相關性（P<0.01），而總酚和總黃酮含量與羥基自由基清除能力呈極顯著負相關性（P<0.01），VC含量與ABTS+自由基清除能力呈顯著負相關性（P<0.05）；與寇婷婷等[38]研究發現相似，土豆提取物中總酚含量與羥基自由基清除能力呈負相關性，總黃酮與羥基自由基清除能力呈非常顯著負相關性（P<0.01）。抗氧化能力強弱，可能是由總酸、總黃酮、總酚、VC等物質含量的相互影響共同決定。

表 1 經標準化處理后各參數的相關性分析Table 1 Correlation analysis of parameters after normalization

2.8 氧化應激防護作用

從2.6可知，發酵至第28 d，樣品的羥基自由基清除能力最強，ABTS+自由基清除能力也略高于50%，選取發酵28 d的樣品，通過細胞實驗，考察其氧化應激防護作用。

2.8.1 毒性試驗結果 本研究選取扁桃斑鳩菊葉酵素及VC不同濃度檢測器其對WRL-68細胞存活率的影響，結果如表2所示。酵素組相比空白對照組，僅VAJ10存在極顯著性差異（P<0.001），其他濃度下細胞存活率無顯著性差異，所以選擇VAJ20、VAJ40、VAJ60、VAJ80濃度測定其對細胞氧化應激保護作用。VC組相比空白對照組，僅0.25 mg/mL濃度作用下無顯著性差異，故選擇此濃度VC做陽性對照。

表 2 不同濃度VAJ及VC對WRL-68細胞存活率的影響Table 2 Effects of different concentrations of VAJ and VC on the survival rate of WRL-68 cells

2.8.2 氧化應激模型建立 用不同濃度H2O2進行造模，作用于WRL-68細胞，構建氧化應激損傷模型。選取400~1200 μmol/L的H2O2，處理8 h，對細胞存活率的影響如圖7所示，WRL-68細胞的存活率隨著H2O2濃度的增加呈逐漸降低趨勢。與空白對照組相比，400~1200 μmol/L H2O2能極顯著抑制細胞增殖（P<0.001），且呈明顯的劑量依賴性。當H2O2濃度為800 μmol/L時，對WRL-68細胞的抑制率為53.21%±2.80%，接近半數抑制濃度，選取此濃度用于建立氧化應激損傷模型。

圖 7 H2O2濃度對WRL-68細胞存活率的影響Fig.7 Effect of H2O2 concentration on viability of WRL-68 cells

2.8.3 扁桃斑鳩菊葉酵素對WRL-68細胞氧化應激損傷的存活率影響 扁桃斑鳩菊葉酵素及H2O2作用WRL-68細胞后細胞存活率如圖8所示，模型組細胞存活率降至48.98%±1.20%。VC-0.25、VAJ20、VAJ40、VAJ60、VAJ80細胞存活率較模型組分別提高至74.14%±1.07%、68.22%±3.82%、61.18%±3.86%、57.50%±1.29%及52.58%±0.09%。表明不同濃度扁桃斑鳩菊葉酵素樣品均可減緩因H2O2誘導而引起的氧化損傷，且存在濃度依賴性，原因可能是樣品內VC、總酚等成分清除活性氧達到保護細胞免受氧化損傷。

圖 8 VAJ對H2O2誘導WRL-68細胞氧化應激的保護作用Fig.8 Protective effect of VAJ on viability of H2O2-induced WRL-68 cells

2.8.4 扁桃斑鳩菊葉酵素對H2O2誘導的WRL-68細胞內ROS水平及抗氧化酶系影響 H2O2等外界氧化物質的刺激，會使線粒體內產生的ROS含量上升，而SOD、CAT、GSH-Px等酶是生物自帶的抗氧化劑[39]。由表3可知，與對照組相比，模型組ROS含量顯著增加（P<0.01），胞內SOD、CAT、GSH-Px等酶活顯著下降（P<0.001）。說明H2O2誘導的WRL-68細胞氧化損傷模型造模成功。和模型組相比較，各組扁桃斑鳩菊葉酵素樣品都能極顯著降低ROS的量（P<0.001）。

表 3 不同濃度VAJ對H2O2作用WRL-68細胞后胞內ROS、SOD、CAT、GSH-Px的影響Table 3 Effect of VAJ on intracellular ROS、SOD、CAT、GSH-Px in H2O2-induced WRL-68 cells

WRL-68細胞經800 μmol/L H2O2作用8 h，細胞因氧化損傷造成半數抑制。經酵素樣品預處理再用H2O2誘導氧化應激損傷，與模型組相比，不同濃度的扁桃斑鳩菊葉酵素VAJ20、VAJ40、VAJ60、VAJ80可顯著提高H2O2誘導的WRL-68細胞內SOD活力（P<0.05、P<0.001、P<0.001、P<0.001），且VAJ20組效果接近VC組；各組胞內CAT活力都有所提高，尤其是VAJ20組，較模型組提高了29.32%，有效減緩因H2O2引起的CAT活力下降，VAJ40、VAJ60、VAJ80胞內CAT活力相比模型組也都有所提高（P<0.001），酵素在稀釋20~60倍情況下對于CAT活力影響差異較小；經酵素樣品預處理后，GSH-Px活力都顯著提升，和模型組相比較存在極顯著差異（P<0.001），其中VAJ40組GSH-Px活力比模型組提高了417.70%，有效減緩了因H2O2引起的GSH-Px活力下降。實驗中各組抗氧化酶系活力的提高，可能是在扁桃斑鳩菊葉酵素發酵過程，生成某些具有抗氧化活性的小分子物質，提高抗氧化酶系到正常水平，起到抗氧化應激保護的作用[40]。

3 結論

本研究以扁桃斑鳩菊葉為原料，通過自然發酵制備酵素，監測發酵過程中各理化指標及體外抗氧化能力的變化，并進行相關性分析。酵素各指標與葉水提物對比，發酵后可以提高扁桃斑鳩菊葉蛋白質、總酚與VC含量，而總酚與VC在抗氧化方面具有重要的作用。抗氧化實驗方面，酵素相比水提物表現出更強的羥基自由基清除能力。在細胞氧化應激方面，可能因代謝生成某些小分子功能成分，酵素能夠通過提高胞內抗氧化酶系SOD、CAT、GSH-Px的酶活力，起到氧化應激損傷的防護作用。通過以上實驗，能較好地評價扁桃斑鳩菊葉酵素的抗氧化能力，且發酵后相比較水提物能提高蛋白質、總酚與VC含量，證明了發酵扁桃斑鳩菊葉具有一定的優勢，以此為扁桃斑鳩菊葉酵素產業的應用開發提供一定的數據支撐。