超高效液相色譜串聯質譜法測定豆類食品中的游離神經遞質類氨基酸

羅 葵，宋學英

（首都醫科大學中心實驗室，北京 100069）

神經遞質類氨基酸是人體內的重要組成物質，參與各種代謝途徑，可通過調控中樞神經元的興奮或抑制，參與神經元信息傳遞、認知、學習和記憶等過程[1?2]。據文獻[3?7]報道，神經遞質類氨基酸主要有甘氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺等，可分為興奮性和抑制性兩類，興奮性神經遞質類氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸等，抑制性神經遞質類氨基酸包括γ-氨基丁酸和甘氨酸等。γ-氨基丁酸和谷氨酸參與調節學習和記憶過程[8?9]，γ-氨基丁酸還能改善睡眠和預防抑郁[10?11]，天冬氨酸與智能、情緒和警覺性有關[12]，甘氨酸對傳遞痛覺信息、加工聽覺信息和處理傳感信號必不可少[13]。谷氨酰胺在神經傳遞中的主要作用是參與谷氨酸/γ-氨基丁酸-谷氨酰胺循環，可緩解疼痛和治療抑郁等[14]。天冬酰胺可通過天冬酰胺合酶由天冬氨酸合成，該酶的缺陷會導致大腦結構異常和認知障礙[6]。

神經遞質類氨基酸不僅在神經系統中發揮著重要的作用，在非神經系統中也有重要的生理意義。γ-氨基丁酸能調節免疫[15]、保護和改善胰島功能[16?18]。谷氨酸在體內外調節肝細胞群的共同節律[19]。甘氨酸參與保護心血管功能[20]。谷氨酰胺參與免疫調節[21]。

人類飲食不僅直接影響身體狀況，也會影響大腦功能和精神狀態[22]。食品是神經遞質類氨基酸的天然來源，飲食調整和補充在神經疾病等許多疾病的治療中有積極的作用[23]。神經遞質類氨基酸廣泛存在于食品中，其中黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆等豆類食品不僅含有豐富的神經遞質類氨基酸，同時也是人們膳食中普遍常見且不可缺少的部分[24]。因此，建立黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆這4種豆類食品中神經遞質類氨基酸的檢測方法非常有必要。

目前，氨基酸和神經遞質的檢測方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[25?27]、液質聯用（LC-MS）法[28?30]、電化學法[31]、氨基酸自動分析儀法[32?33]、離子色譜法[34]、氣質聯用（GC-MS）法[35?36]等。其中，液相色譜法和氣質聯用法檢測氨基酸需要做柱前衍生化處理，前處理過程復雜，而氨基酸自動分析儀法耗時比較長。因此，本文在已有的文獻研究基礎上，簡化前處理方法，優化儀器測定條件，建立豆類食品中神經遞質類氨基酸的檢測方法，以期為豆類食品的質量控制提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆 產地均為山東，購于市場；乙酸銨、甘氨酸（glycine, Gly）、谷氨酸（glutamate, Glu）、谷氨酰胺（glutamine, Gln）、天冬氨酸（Aspartic acid, Asp）、天冬酰胺（Asparagine,Asn）和γ-氨基丁酸（Gamma aminobutyric acid，GABA）

美國Merck公司，純度≥98%；甲醇、乙腈、甲酸

美國Fisher公司，色譜純。

1290超高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Qtrap 6500三重串聯四極桿質譜儀 配有電噴霧離子源（ESI）、Analyst采集軟件及Multi Quant數據處理軟件，美國AB SCIEX公司；MS204型電子天平

梅特勒-托利多儀器（上海）公司；MS3 Digital渦旋混勻器 德國IKA公司；Fresco21離心機 美國Thermo Scientific公司；KQ-500E超聲波清洗器（功率500 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q型超純水機 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 分別稱取適量的甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺和γ-氨基丁酸標準品用超純水配制成1 mg/mL單標標準品儲備液，儲存于4 ℃冰箱中。取適量各標準儲備液，用超純水稀釋成0.5 mg/mL混合標準溶液，用于繪制標準曲線。

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SBAq RRHT（3.0 mm×100 mm, 1.8 μm）；柱溫：25 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：1 μL。流動相為：A為0.5 mmol/L乙酸銨水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0~1 min, 30% B；1~2 min，30%~90% B；2~3 min，90% B；3~4 min，30% B。

1.2.2.1 色譜柱的選擇 分別使用SB-C18（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）、Zorbax SB-Aq RRHT（3.0 mm×100 mm, 1.8 μm）和Eclipse Plus C18RRHD（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）三種不同的色譜柱對1 μg/mL的甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺和γ-氨基丁酸混合標準品溶液進行檢測，考察色譜柱對目標化合物的分離效果及峰形的影響。

1.2.2.2 流動相的優化 首先分別使用水-甲醇和水-乙腈作為流動相進行檢測，考察對目標化合物響應強度的影響，然后分別使用0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.5 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇作為流動相進行檢測，考察對目標化合物分離度和峰形的影響。

1.2.2.3 柱溫的選擇 分別使用20、25、30、35、40、45 ℃柱溫進行檢測，考察柱溫對目標化合物響應強度的影響。

1.2.3 質譜條件 離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；監測模式：多反應監測（MRM）；離子源溫度：550 ℃；離子化電壓：4500 V；霧化氣（N2）壓力：55 psi；氣簾氣（N2）壓力：35 psi；輔助加熱氣（N2）為55 psi；各目標化合物的質譜參數見表1。

表 1 6種神經遞質類氨基酸的質譜采集參數Table 1 MS acquisition parameters of 6 neurotransmitter amino acids

1.2.4 樣品前處理 在相關文獻的研究[37?39]基礎上，采用水作為溶劑，超聲提取目標化合物。分別稱取粉碎后過60目篩的黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆粉末2.5 mg于1.5 mL離心管中，加入1 mL超純水，渦旋混勻后，超聲提取30 s，以13500 r/min離心10 min，取上清液經0.22 μm濾膜過濾，供UPLCMS/MS分析。

1.2.4.1 提取料液比的優化 分別稱取2.5、5、10、20、50、80 mg豆類食品粉末，加入1 mL超純水，混勻，超聲提取30 s，過0.22 μm濾膜后，進樣檢測。

1.2.4.2 超聲提取時間的優化 稱取2.5 mg豆類食品粉末，加入1 mL超純水，混勻，分別超聲提取10、20、30、60、120、300、600、1200 s，過0.22 μm濾膜后，進樣檢測。

1.2.5 方法學驗證

1.2.5.1 線性關系、檢出限與定量限的測定 配制濃度為1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000 μg/L的6種神經遞質類氨基酸混合標準工作溶液，進行測定，以質量濃度為橫坐標，對應的定量離子峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并計算信噪比，以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限。

1.2.5.2 加標回收率實驗 在已知含量的樣品溶液中分別添加低、中、高3個濃度水平的混合標準溶液，各濃度水平6個平行樣本分析，計算各目標化合物的平均回收率。

1.2.5.3 穩定性、精密度和重復性實驗 取6份平行的樣品按1.2.4方法處理后，分別在0、2、4、8、12、24、48、72 h測定，進行穩定性試驗。取1份樣品溶液連續進樣測定6次，進行精密度試驗。取6份平行的樣品溶液進行測定，進行重復性試驗。在上述試驗中，記錄各目標化合物的峰面積，并計算相對標準偏差（RSD）。

1.2.6 樣品測定 用1.2.4方法對市售的黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆等4種豆類食品進行前處理，用1.2.2和1.2.3方法進行上樣檢測。

1.3 數據處理

采用Analyst 1.6.2軟件控制儀器，采集數據，Multi Quant 3.0.1軟件進行數據處理，Excel 2010軟件進行數據匯總和分析，Origin 2021軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇 使用SB-C18色譜柱和Eclipse Plus C18RRHD色譜柱對1 μg/mL混合標準品溶液進行檢測時，分離度不如Zorbax SB-Aq RRHT色譜柱，且基線噪音較高，最終選擇Zorbax SB-Aq RRHT（3.0 mm×100 mm, 1.8 μm）色譜柱（見圖1）。

圖 1 不同色譜柱對6種神經遞質類氨基酸檢測的影響Fig.1 Effect of different columns on the detection of 6 neurotransmitter amino acids

2.1.2 流動相的優化 使用水-甲醇作為流動相時，目標化合物的響應強度略高于使用水-乙腈作為流動相時的響應強度，但在水-甲醇和水-乙腈兩種流動相體系里，目標化合物的分離度和峰形都有待改善，因此，考慮在流動相中加入甲酸、乙酸銨等改性劑。使用0.1%甲酸水溶液-甲醇做流動相時，響應強度低，分離度差且基線噪音高（見圖2）。因此，最終選擇0.5 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇體系作為流動相。

2.1.3 柱溫的優化 柱溫對目標化合物的響應強度沒有明顯的影響（見圖3），最終選擇接近于室溫的25 ℃作為柱溫。

圖 2 不同流動相對6種神經遞質類氨基酸檢測的影響Fig.2 Effect of different mobile phases on the detection of 6 neurotransmitter amino acids

2.2 質譜條件優化

神經遞質類氨基酸均屬于極性化合物且化學結構中含有氨基，易結合H+，因此，采用正模式測定。分別配制濃度為1 μg/mL的各目標化合物單標溶液，使用針泵恒流進樣的方式注入離子源，首先進行一級質譜掃描，確定各目標化合物的母離子為[M+H]+，然后進行產物離子掃描，確定2個響應強、干擾小的特征碎片離子，優化去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE），使得確定的兩個子離子響應最佳。6種神經遞質類氨基酸的總離子流圖（TIC）見圖4，提取離子譜圖（XIC）見圖5。

圖 3 柱溫對6種神經遞質類氨基酸響應強度的影響Fig.3 Effect of column temperature on response intensity of 6 neurotransmitter amino acids

圖 4 6種神經遞質類氨基酸的總離子流圖（TIC）Fig.4 Total ion chromatogram(TIC) of 6 neurotransmitter amino acids

2.3 樣品前處理方法的優化

2.3.1 提取料液比的優化 隨著豆類食品粉末在水溶液中的比例越來越小，基線噪音越來越小，同時目標化合物的響應也越來越高（見圖6），最終選擇2.5 mg豆類食品粉末加入1 mL超純水的提取比例。

2.3.2 超聲提取時間的優化 隨著超聲提取時間的延長，目標化合物的響應強度先小幅上升，在超聲提取時間為30 s時達到最大，隨后開始下降，在超聲提取時間延長到600 s以上時，目標化合物的響應強度開始大幅下降（見圖7），最終選擇超聲提取時間為

圖 5 甘氨酸（Gly）、γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、天冬氨酸（Asp）和天冬酰胺（Asn）的提取離子譜圖（XIC）Fig.5 Extracted ion chromatogram(XIC) of Gly, γ-GABA, Glu, Gln, Asp and Asn

圖 6 不同提取比例對6種神經遞質類氨基酸檢測的影響Fig.6 Effect of different extraction ratio on response intensity of 6 neurotransmitter amino acids

圖 7 不同超聲提取時間對6種神經遞質類氨基酸響應強度的影響Fig.7 Effect of ultrasonic extraction time on response intensity of 6 neurotransmitter amino acids

30 s。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系、檢出限與定量限 6種目標化合物在各自范圍內線性良好，相關系數（r）為0.991~0.999。以信噪比S/N≥3計算，檢出限（LOD）為2~8 μg/kg，以信噪比S/N≥10計算，定量限（LOQ）為8~40 μg/kg（見表2）。

2.4.2 加標回收率 各目標化合物的平均回收率為80.30%~109.97%，相對標準偏差（RSD）為0.12%~7.20%（見表3）。

2.4.3 穩定性、精密度和重復性 穩定性實驗的相對標準偏差（RSD）值為4.74%~6.98%，精密度實驗的RSD值為0.63%~7.27%，重復性實驗的RSD值為0.46%~5.17%（見表4）。

2.5 樣品的測定

樣品測定結果如表5所示，黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆四種豆類食品中的甘氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺的平均含量（n=6）分別為14.96~56.89、6.37~59.6、443.43~653.63、9.15~22.47、71.54~95.06和472.08~2880.17 μg/g。

表 2 6種神經遞質類氨基酸的線性關系、檢出限與定量限Table 2 Liner relationships, LODs and LOQs of 6 neurotransmitter amino acids

表 3 6種神經遞質類氨基酸的加標回收率和相對標準偏差RSD（n=6）Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 6 neurotransmitter amino acids(n=6)

表 4 穩定性、精密度和重復性試驗的相對標準偏差RSD（n=6）Table 4 The RSDs of stability, precision and repeatability tests (n=6)

表 5 豆類食品中6種神經遞質類氨基酸的含量Table 5 Content of 6 neurotransmitter amino acids in legume foods

3 結論與討論

神經遞質類氨基酸是極性化合物，而黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆都是固體食品，本文在相關文獻[30,40?43]的研究基礎上，采用超聲輔助水提取法，提取豆類食品中的神經遞質類氨基酸，通過優化前處理方法、色譜條件和質譜參數，建立了4種豆類食品中同時檢測6種神經遞質類氨基酸的UPLCMS/MS分析方法。谷氨酰胺在1~100 μg/L范圍內，天冬氨酸在5~500 μg/L范圍內，甘氨酸和γ-氨基丁酸在10~200 μg/L，谷氨酸和天冬酰胺在100~2000 μg/L范圍內，線性關系良好，相關系數（r）在0.991~0.999之間，在低、中、高三個不同加標濃度下的回收率為80.30%~109.97%，相對標準偏差（RSD）為0.12%~7.20%，檢出限和定量限分別為2~8、8~40 μg/kg。用該方法測得的黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆等四種豆類食品中甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的含量低于文獻[44?47]中所報道的含量，原因在于該方法檢測的是游離態神經遞質類氨基酸，而文獻報道的是游離態和水解之后的結合態神經遞質類氨基酸的總含量。黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆等四種豆類食品中的天冬酰胺、谷氨酰胺和γ-氨基丁酸的含量尚未見文獻報道。

本文所建立的方法前處理簡單、分析時間短、靈敏度和準確度高，適用于黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆4種豆類食品的檢測，可推廣應用于固體豆類食品中神經遞質類氨基酸的檢測分析，也為固體食品中氨基酸的測定提供參考，為我國的食品安全和質量控制提供技術支持。