粉防己堿靶向TNF-α介導PI3K/Akt/NF-κB信號通路抑制骨質疏松癥的作用研究

侍 方，倪 磊

在人類所有慢性代謝性骨病中，骨質疏松癥最為常見，現約有2億患者[1]，其與生理性或病理性雌激素降低密切相關。骨質疏松癥在絕經后婦女中發生率顯著升高，稱為絕經后骨質疏松癥(PMOP)[2]。PMOP發病涉及系統性炎癥激活[3]。粉防己堿(TET)是從粉防己根部提取的活性物質，在抗炎、抗腫瘤、促自噬和凋亡方面發揮作用[4-5]。研究表明，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因存在多個多態性位點，與PMOP發生密切相關[6]。在去勢骨質疏松癥小鼠中，TNF-α水平與骨丟失、成骨細胞和骨細胞死亡呈正相關[7]。此外，研究發現NF-κB信號通路也參與了PMOP的進程，草烏甲素可降低NF-κB信號通路活性、抑制破骨細胞生成從而達到促進成骨細胞生成的效果[8]。最新研究發現，在去勢骨質疏松癥兔模型中，TET通過減少TNF-α的產生抑制NF-κB信號通路激活，降低p65磷酸化水平，進而發揮治療骨質疏松癥的作用[9]。但在骨質疏松癥發生過程中，TET通過何種機制作用于TNF-α及NF-κB信號通路，以及這2個信號通路間的相互關系尚不清楚。因此，本研究構建去勢骨質疏松癥兔模型對此問題進行解析,為TET治療骨質疏松癥提供更深層次的理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物 新西蘭兔，雌性，20周齡，體質量3.0～3.5 kg，購自北京實驗動物研究中心。實驗動物許可證號：SYXK(京)2020-0038。

1.2主要試劑與儀器

1.2.1試劑：TET(美國Sigma公司)，MinuteTM骨組織總蛋白提取試劑盒[中國西寶生物科技(上海)有限公司]，兔TNF-α ELISA試劑盒(美國R&D公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國ThermoFisher公司)，抗兔β-actin、p85、p-p85、Akt、p-Akt、p65、p-p65、IκBαp-IκBα抗體(美國CST公司)，Anti-Rabbit IgG (美國Abcam公司)，化學發光底物(美國ThermoFisher公司)。

1.2.2儀器：Micro-CT小動物活體影像系統(LCT-200，Latheta公司)，酶標儀(ELX808，BioTek公司)。

1.3研究方法

1.3.1去勢骨質疏松癥兔模型的構建：參考文獻[9-10]，采用雙側卵巢切除術法構建骨質疏松癥兔模型。模型兔隨機分為造模組、TET組，未切除雙側卵巢的假手術組作為對照組，每組6只。TET組每3天腹腔注射TET 40 mg/kg，對照組和造模組處理時換為生理鹽水，持續4周[9]。處理后各組兔予戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，Micro-CT檢測骨密度(BMD)、相對骨體積(BV/TV)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)及骨小梁間距(Tb.Sp)，以評價兔骨質疏松程度。

1.3.2ELISA檢測TNF-α水平：分離各組兔脛骨組織，根據試劑盒操作說明提取總蛋白，采用兔TNF-α ELISA試劑盒測定TNF-α水平。

1.3.3Western blot法檢測骨組織相關蛋白表達：嚴格按照試劑盒提供的操作指南提取各組兔骨組織。采用12.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，90 V電泳1.5～2.0 h；冰浴條件下100 mA固定電流轉膜1 h，將分離的蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；配制含4.2%脫脂牛奶的TBST緩沖液，封閉PVDF膜；按比例加入抗兔β-actin、p85、p-p85、Akt、p-Akt、p65、p-p65或IκBαp-IκBα抗體，4℃孵育過夜；TBST緩沖液充分洗滌3次，每次15 min；按比例加入Anti-Rabbit IgG二抗，室溫孵育1 h；TBST緩沖液再次充分洗滌后，加入顯影液顯影。實驗重復3次，最后經Image J軟件分析蛋白含量,蛋白相對表達量=目標蛋白/β-actin。

2 結果

2.1TET處理對兔骨質疏松癥的保護作用 TET組與造模組相比，兔骨組織BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th升高(P<0.05)，Tb.Sp降低(P<0.01)；造模組與對照組相比，兔骨組織BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均顯著下降(P<0.01)，Tb.Sp顯著升高(P<0.01)。見圖1。

圖1 TET處理對骨質疏松癥模型兔關節軟骨及骨形成的影響TET為粉防己堿；與造模組比較，aP<0.05,bP<0.01；與對照組比較，cP<0.01

2.2TET處理對兔脛骨組織中TNF-α的影響 對照組脛骨組織中TNF-α含量為(35.8±3.6)pg/ml，造模組為(58.6±5.2)pg/ml，TET組為(45.7±4.9)pg/ml，造模組兔脛骨組織中TNF-α含量顯著高于對照組(P<0.01)，TET組顯著低于造模組(P<0.01)。見圖2。

圖2 各組骨質疏松癥模型兔脛骨組織中TNF-α水平比較TET為粉防己堿,TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與對照組比較，aP<0.01；與造模組比較，bP<0.01

2.3TET處理對PI3K/Akt信號通路活性的抑制作用 與對照組相比,造模組兔骨組織中p-p85和p-Akt表達水平顯著升高(P<0.01)；而TET處理可顯著降低兔骨組織中p-p85和p-Akt表達水平(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組骨質疏松癥模型兔骨組織中PI3K/Akt信號通路蛋白表達情況TET為粉防己堿；與對照組比較，aP<0.01；與造模組比較，bP<0.01

2.4TET處理對NF-κB信號通路活性的抑制作用 與對照組相比，造模組兔骨組織中p-IκBα和p-p65相對表達量均顯著升高(P<0.01)；與造模組相比，TET組顯著抑制兔骨組織中p-IκBα和p-p65相對表達量(P<0.01)。見圖4。

圖4 各組骨質疏松癥模型兔骨組織中p-IκBα和p-p65蛋白表達情況TET為粉防己堿；與對照組比較，aP<0.01；與造模組比較，bP<0.01

3 討論

在慢性代謝性骨病中，骨質疏松癥最為常見，其是因生理性或病理性骨密度降低或骨結構惡化而導致患者骨折風險增高的一種疾病[11-13]。相對于男性，女性骨質疏松癥發病率高，絕經后女性發病率尤高，稱為PMOP。PMOP是一種涉及系統性炎癥激活的骨代謝疾病[3]。研究發現，PMOP與雌激素缺乏密切相關[14-18]。絕經后女性體內雌激素水平下降，可引起核因子-κB受體活化因子/核因子-κB受體活化因子配體(RANK/RANKL)信號通路和炎癥相關信號通路激活，TNF家族細胞因子合成和釋放增加[19]。Xu等[20]研究發現，TNF-α可誘導SOX5上調，并調控KLF4信號通路，從而抑制人骨髓間充質細胞的成骨分化。在去勢骨質疏松癥兔模型中，通過抑制TNF-α能夠有效緩解病情[9]。此外，與健康絕經女性相比,PMOP患者血清TNF-α水平升高，而且TNF-α水平與RANK和雌激素水平相關[21]。以上研究結果表明，TNF-α介導了PMOP的發生。

有研究還發現，在去勢骨質疏松癥小鼠模型中，四物湯可影響其PI3K/Akt和NF-κB信號通路活性，從而刺激骨形成[22]。Zha等[21]發現TNF-α可激活RAW264.7細胞系中PI3K/Akt信號通路，協同提高NF-κB信號通路活性，增加IκBα和p65磷酸化水平；TNF-α可增強RANKL誘導的NF-κB信號通路激活，促進破骨細胞增殖。因此推測PMOP患者血清中高水平的TNF-α可激活PI3K/Akt信號通路，從而促進破骨細胞增殖導致骨質疏松癥。本研究發現，在去勢骨質疏松癥兔模型中，BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th顯著降低，而Tb.Sp則顯著升高；造模組兔脛骨組織中TNF-α含量高于對照組，同時伴隨PI3K/Akt信號通路的激活，IκBα和p65磷酸化水平也顯著升高。結果表明，在去勢骨質疏松癥兔模型中，骨組織中TNF-α含量增加可激活PI3K/Akt/NF-κB信號通路，促進破骨細胞增殖而導致骨質疏松癥。

TET是從粉防己根中提取獲得的天然活性物質[23]，除具有抗腫瘤、促凋亡和抗氧化等作用外，還具有顯著的抗炎活性[24-27]。最新研究表明，TET可在體外抑制TNF-α的產生，抑制p65磷酸化水平，抑制RANKL誘導的破骨細胞增殖效應[9]。本研究同樣發現，TET處理后可顯著升高去勢骨質疏松癥兔模型脛骨組織中BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th，降低Tb.Sp、TNF-α含量，抑制p85、Akt、IκBα和p65磷酸化，抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路活性，繼而減輕骨質疏松癥癥狀。本研究證實了TNF-α通過激活PI3K/Akt信號通路促進下游NF-κB信號通路活性,是導致骨質疏松癥的主要分子機制;TET可靶向抑制TNF-α的產生，發揮治療骨質疏松癥的作用。

綜上,TET可抑制TNF-α介導的PI3K/Akt/NF-κB信號通路激活,減輕病情，是治療PMOP的有效藥物,為其臨床應用奠定了基礎。