miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141與胸腔鏡肺癌微創術后復發的關系及聯合預測價值分析

劉鴻運，張曙光，于四海

目前肺癌已成為我國城市人口死亡的主要因素[1]，胸腔鏡肺癌微創術是治療肺癌的主要術式，具有微創、術后恢復時間短等優勢，但術后仍有30.0%～40.0%的患者死于肺癌復發[2-3]。因此，積極尋找一種預測肺癌復發的有效指標，對制定個性化治療方案、改善預后具有重要的臨床價值。富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)表達升高可激活腫瘤細胞內絲裂原活化蛋白激酶信號通路，從而參與惡性腫瘤的發生、發展[4]。另有學者指出，微小RNA(miR)在多種腫瘤組織中異常表達，而miR-21、miR-141在腫瘤細胞增殖、侵襲等方面起重要作用[5-6]，但關于其與Cyr61 mRNA聯合預測胸腔鏡肺癌微創術后復發的臨床價值尚缺乏循證支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月—2020年1月我院收治的361例行胸腔鏡肺癌微創術患者，其中男234例，女127例；年齡47～73(61.18±5.32)歲。納入標準：符合肺癌診斷標準[7]，并經手術病理學檢查證實診斷；具有胸腔鏡肺癌微創術指征。排除標準：遠處轉移者；有放化療及免疫治療史者；合并其他部位腫瘤者；合并肺部感染或其他部位感染者；凝血功能紊亂或活動性出血者；組織標本污染者；合并重度抑郁癥、精神分裂癥或其他精神疾病者。

1.2研究方法 記錄所有患者術后6個月復發情況，根據復發情況分為復發組30例、未復發組331例，比較2組miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141水平；采用多因素Logistic回歸分析尋找胸腔鏡肺癌微創術后復發的影響因素；采用受試者工作特征(ROC)曲線分析miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141單一及聯合檢測對胸腔鏡肺癌微創術后復發的預測價值；繪制K-M生存曲線，采用Log-rank檢驗分析miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141水平與生存率的關系。

1.3檢測方法 取手術切除病灶組織，應用Trizol試劑促進細胞裂解，添加氯仿0.2 ml，4℃條件下12 000 r/min離心15 min，取無色水相上層，添加等體積異丙醇并沉淀。加入適量乙醇(75%)清洗，獲取RNA沉淀，清除上層乙醇溶液，25℃條件下空氣干燥5～10 min。紫外光吸收法檢測RNA純度及濃度，使用北京諾博萊德科技有限公司生產的逆轉錄試劑盒合成樣品cDNA。采用百奧邁科生物技術有限公司生產的熒光定量PCR試劑盒測定組織miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141表達量。

2 結果

2.12組臨床資料比較 2組淋巴結轉移、miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 2組行胸腔鏡肺癌微創術患者臨床資料比較

2.2不同miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141水平患者術后復發率比較 以2組各指標均值分界(miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141均值分別為0.80、0.84、2.03)，將患者分為miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141高表達與低表達者。miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141高表達者復發率高于低表達者(P<0.01)。見表2。

表2 不同miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141水平的胸腔鏡肺癌微創術患者術后復發率比較[例(%)]

2.3多因素Logistic回歸分析 以miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141作為自變量，低于均值=1、高于均值=2，以復發為因變量，未復發=0、復發=1，應用多因素Logistic回歸方程進行分析，結果顯示，miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141是胸腔鏡肺癌微創術后復發的影響因素(P<0.01)。見表3。

表3 胸腔鏡肺癌微創術后復發的多因素Logistic回歸分析

2.4miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141預測術后復發的ROC曲線分析 以復發組為陽性樣本，以無復發組為陰性樣本，繪制各指標預測胸腔鏡肺癌微創術后復發的ROC曲線，結果顯示，miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141單一及聯合檢測預測術后復發的曲線下面積(AUC)依次為0.749、0.738、0.813及0.896。見圖1、表4。

表4 miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141單一及聯合檢測預測胸腔鏡肺癌微創術后復發的ROC曲線分析

圖1 miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141單一及聯合檢測預測胸腔鏡肺癌微創術后復發的受試者工作特征曲線

2.5不同miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141水平者生存率比較 miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141高水平者生存率低于低水平者(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141水平的胸腔鏡肺癌微創術患者術后生存率比較

3 討論

既往研究證實，miR-21對胃癌、HER2陽性乳腺癌治療結局有一定預測價值[8-9]。但上述研究傾向于離體細胞，關于其在胸腔鏡肺癌微創術后復發患者中表達的相關報道較少。本研究結果顯示，miR-21在胸腔鏡肺癌微創術后復發患者中異常高表達，原因可能為miR-21過度表達可激活第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因/激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路，促使腫瘤細胞間質轉化，誘導腫瘤細胞異常生長，從而參與術后復發進程[10-11]。多因素Logistic回歸分析顯示，miR-21是胸腔鏡肺癌微創術后復發的影響因素，再次佐證了miR-21有望成為預測術后復發的潛在指標。非小細胞肺癌組織miR-21高表達可提示患者整體生存率下降，這可能歸因于miR-21表達升高通過對PETN等基因表達進行靶向調控，誘導新生血管形成，增強腫瘤細胞浸潤與侵襲作用，從而促使腫瘤細胞異常增殖，加快腫瘤細胞轉移，進而導致不良預后[12]。

Cyr61生物學功能較為復雜，多篇文獻指出，其可作為腫瘤新生血管形成的重要參與因子，調控細胞增殖[13-15]。本研究術后復發患者癌組織Cyr61 mRNA顯著高于未復發者，與何開明等[16]研究結果相似，這可能是由于Cyr61一方面可結合細胞膜上配體，提高整聯蛋白耦聯激酶活性，活化Wnt/β-catenin信號通路；另一方面可調控血管內皮生長因子及其受體表達，激活下游靶基因，異常增殖血管內皮細胞，促進新生血管形成，從而增加術后復發危險性。但段亞男等[17]研究認為，肺癌患者癌組織Cyr61蛋白表達陽性率顯著下降，與本研究結果存在一定差異，可能與樣本量、檢測方法不同等因素有關。進一步通過K-M曲線分析可知，Cyr61 mRNA表達升高可降低胸腔鏡肺癌微創術患者生存率，可能與其表達升高一定程度破壞下游細胞外基質合成與分解平衡，誘導腫瘤細胞轉移有關。提示Cyr61有助于反映胸腔鏡肺癌微創術患者預后。

miR-141位于人類染色體12p13.31位點，國內外研究均已證實，其在前列腺癌、卵巢上皮癌、鼻咽癌中均異常表達[18-20]。本研究表明，miR-141高表達患者術后復發率顯著高于低表達患者，其原因可能為miR-141高表達通過結合長鏈非編碼RNA XIST，上調轉化生長因子-β與細胞程序性死亡蛋白4含量，誘導腫瘤細胞異常增殖與上皮間質轉化，調控腫瘤細胞增殖、凋亡、永生化等多種生物學效應，從而參與術后復發進程[21]。進一步研究還發現，miR-141高水平可能增加胸腔鏡肺癌微創術患者病死率，究其原因可能為miR-141表達上調可加重腫瘤惡性程度，進而影響患者生存率。然而miR-141單一檢測預測胸腔鏡肺癌微創術后復發的敏感度較低，存在一定局限性，本研究ROC曲線顯示，miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141聯合檢測預測術后復發的AUC最大，預測價值最佳。由此可見，miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141聯合檢測對胸腔鏡肺癌微創術后復發、預后具有重要的預測價值。

綜上，miR-21、Cyr61 mRNA、miR-141在胸腔鏡肺癌微創術后復發患者中過度高表達，上述指標聯合檢測可為臨床預測胸腔鏡肺癌微創術患者術后復發與預后提供一種新手段。