急性腸梗阻腸壞死患兒A2B腺苷受體、緊密連接蛋白、腫瘤壞死因子-α表達及與腸上皮細胞凋亡的相關性分析

張雪峰，張麗莉，李明暉

急性腸梗阻是因任何原因引起的部分或全部腸內容物通過障礙，是臨床最常見的急腹癥[1]。小兒腸梗阻臨床表現為腹痛、嘔吐、腹脹、肛門停止排便排氣，嚴重影響患兒生長發育，嚴重者可并發腸壞死，升高病死率。研究顯示，梗阻導致腸壞死的發生可能與腸道黏膜功能障礙造成腸道菌群環境改變有關，通過探討相關機制可能為急性腸梗阻腸壞死的治療帶來新契機[2]。A2B腺苷受體(A2BAR)參與調節機體多種生理及病理過程，包括刺激內皮細胞生長、調節炎性因子釋放、調節腸道氯離子分泌等[3]。緊密連接蛋白為緊密連接復合體重要組成蛋白，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)為引起感染性休克和組織損傷的重要炎癥介質，二者與急性腸梗阻腸壞死患兒細菌移位存在明顯關系[4]。本研究通過分析65例急性腸梗阻腸壞死患兒的臨床資料，探討A2BAR、緊密連接蛋白、TNF-α在急性腸梗阻腸壞死患兒中的表達及與腸上皮細胞凋亡的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院2015年4月—2020年2月行手術治療的急性腸梗阻腸壞死患兒65例作為研究組。納入標準：①符合急性腸梗阻腸壞死的診斷標準[5]；②年齡2～14歲；③入組前未接受過相關治療者；④臨床資料完整。排除標準：①合并其他系統疾病者；②患有盆、腹腔巨大腫塊者；③患有彌漫性腹膜炎伴腸梗阻者；④患有腹部疝或橫膈疝者；⑤合并心腦血管或造血系統等嚴重疾病者。研究組中男34例，女31例；年齡2～14(5.31±2.43)歲；急性腸套疊23例，紫癜合并腸套疊15例，腹內疝13例，腸扭轉6例，粘連性腸梗阻腸絞窄5例，嵌頓性腹股溝斜疝3例。另選擇同期于我院行腸切除吻合術治療的消化道畸形患兒30例作為對照組，入院前均未合并其他疾病，其中男16例、女14例，年齡2～11(5.26±2.35)歲。2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2檢測方法

1.2.1樣本收集：收集65例術中切除的部分腸管作為研究標本，近端約0.5 cm×0.5 cm采用蛋白免疫印跡法處理，其余腸管相應處理后采用免疫組織化學染色法測定A2BAR、緊密連接蛋白。

1.2.2A2BAR、緊密連接蛋白檢測：將術中標本切為4 μm薄片，脫蠟、水化、高壓修復后滴加3%過氧化氫溶液，常溫下滅活內源性酶，封閉，滴入A2BAR抗體3 μg/ml、緊密連接蛋白抗體(1∶300)，4℃過夜后滴加二抗，DAB顯色，常規脫水后封片待測。選用PBS液代替一抗為陰性對照，半定量分析切片(每張切片在400倍鏡下隨機選擇3～4個視野)，陽性表達呈棕黃色顆粒，檢測陽性反應產物的灰度值。見圖1。

圖1 急性腸梗阻腸壞死患兒A2BAR、緊密連接蛋白免疫組織化學染色圖(DAB顯色，蘇木素復染，×400)A.A2BAR，B.緊密連接蛋白，A2BAR為A2B腺苷受體

1.2.3TNF-α檢測：所有患兒在入院時及術后1周抽取靜脈血液3 ml，3000 r/min離心10 min后分離血清，采用酶聯免疫吸附試驗測定TNF-α濃度。

1.3腸上皮細胞凋亡指數(AI)檢測 采用原位末端標記法檢測AI。病理切片常規脫蠟入水，將切片放入新配制的3%過氧化氫溶液中10 min。蒸餾水洗滌3次，每次2 min。標本滴加新稀釋的蛋白酶K中消化15 min，按TdT∶DIG-d-UTP∶標記緩沖液為1∶1∶18比例配制混合液，混勻。TBS液反復沖洗，DAB顯色，蘇木素輕度復染。最后TBS液沖洗，蒸餾水洗滌，脫水，透明，封片。光學顯微鏡觀察，以400倍放大切片，棕黃色顆粒呈現于細胞核中提示細胞凋亡。每張切片按順序選擇5～10個視野，共計數1000個細胞，以TUNEL陽性細胞所占百分比計算AI，AI=陽性細胞數/細胞總數×100%。

2 結果

2.1A2BAR、緊密連接蛋白及TNF-α表達 研究組A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值及AI低于對照組(P<0.05，P<0.01)。與對照組術前比較，研究組術前血清TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；術后7 d，研究組血清TNF-α水平較術前顯著降低(P<0.05)，但與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 手術治療的急性腸梗阻腸壞死和消化道畸形患兒A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值、TNF-α、AI比較

2.2A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值、TNF-α與AI的相關性分析 A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值與AI呈正相關(P<0.01)，TNF-α與AI呈負相關(P<0.01)，見表2和圖2。

表2 急性腸梗阻腸壞死患兒A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值、TNF-α與AI的相關性分析

圖2 急性腸梗阻腸壞死患兒A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值、TNF-α與AI的相關性分析散點圖A2BAR為A2B腺苷受體，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，AI為凋亡指數

3 討論

既往研究指出，急性腸套疊、腸扭轉及嵌頓疝是導致小兒急性腸梗阻腸壞死的主要原因[6]，嚴重者可引發中毒性休克甚至全身炎癥反應綜合征、全身多器官衰竭等，危及患兒生命[7]。由于急性腸梗阻腸壞死病情變化快，需早期做出診斷并處理。

腸屏障是機體重要的屏障結構，對于穩定腸道內環境平衡和阻礙致病菌及毒素進入體內等具有重要作用[8]。目前已有研究表明，小兒急性腸梗阻發生時細菌或其產物穿過腸屏障進入其他器官[9]。但是，目前臨床對于不同病理條件下腸屏障功能變化的作用機制仍存有爭議[10]。有學者提出，腸黏膜損傷后可引發強烈的炎癥反應，而炎性因子TNF-α等又會導致腸道內缺氧，進而對腸黏膜屏障功能產生影響[11]。本文研究組術前TNF-α水平顯著升高，原因在于腸黏膜損傷激活體內絲裂原活化蛋白激酶活性，促進大量炎性因子釋放，進而加重炎癥反應。

A2BAR作為腺苷的一種亞型，與炎性因子分泌、血管松弛及肥大細胞增生均有著密切聯系，現已成為國內外研究的焦點[12]。研究發現，急性血液阻滯和缺氧可誘導腸道內A2BAR表達升高，進而加速各種條件下受損黏膜自我修復過程[13-14]。此外，A2BAR還具有調節巨噬細胞功能、抑制促炎因子TNF-α分泌的作用[15]。本文鏡下觀察發現，研究組腸黏膜上皮細胞膜表面A2BAR表達更為顯著，并且在腸黏膜上皮細胞的多個位置廣泛表達；同時A2BAR灰度值低于對照組，表明急性腸梗阻腸壞死患兒腸管內A2BAR表達升高。

研究表示，緊密連接蛋白可形成緊密的封閉帶，以維持細胞兩端不同的形態或功能和細胞內外的水平衡，并可參與細胞間信號的傳送調節[16]。本研究顯示，急性腸梗阻腸壞死患兒腸管緊密連接蛋白灰度值明顯降低，推測其參與了小兒急性腸梗阻腸壞死的病理生理過程[17]。進一步分析其可能作用機制：腸內血液循環受阻、缺氧時p-p38MAPK活化轉錄因子升高促進了促炎細胞因子的分泌，此類因子激活后可與相應的腸上皮細胞表面特異性死亡受體結合并活化，通過Caspase級聯反應對腸黏膜細胞的程序性凋亡起到激活作用，從而達到減少腸黏膜相關細胞數量的效果[10,18]。

為進一步探討A2BAR、緊密連接蛋白及TNF-α異常表達在急性腸梗阻腸壞死中的作用機制，本研究采用Pearson相關分析觀察急性腸梗阻腸壞死患兒A2BAR、緊密連接蛋白及TNF-α與AI的關系，結果顯示A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值與AI呈正相關，TNF-α與AI呈負相關。表明A2BAR、緊密連接蛋白及TNF-α與急性腸梗阻腸壞死患兒腸上皮細胞大量凋亡關系密切，提示臨床可將三者作為治療靶點，以保障患兒腸黏膜屏障功能的完整性作為臨床治療的新方向[19]。

綜上，A2BAR、緊密連接蛋白及TNF-α在急性腸梗阻腸壞死患兒中異常表達，且與患兒腸上皮細胞大量凋亡關系密切，臨床需重視患兒A2BAR、緊密連接蛋白及TNF-α水平監測，以改善其預后。