RAG1基因新發(fā)突變1例分析及文獻復(fù)習(xí)

劉婉文，楊在東，葉文華

(佛山市婦幼保健院重癥監(jiān)護科，廣東 佛山 528000)

聯(lián)合免疫缺陷病(combined immunodeficiency，CID)是指T淋巴細胞和B淋巴細胞功能聯(lián)合缺陷引起的原發(fā)性免疫缺陷病，以T淋巴細胞缺如尤為嚴(yán)重和突出。患兒早期可出現(xiàn)致死性嚴(yán)重感染、生長發(fā)育障礙及機會性感染。機會性感染最常見的部位是呼吸道，尤其是肺臟[1]，如卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii，PC)、巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染。CID最危重的類型是重癥聯(lián)合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency disease，SCID)，不經(jīng)造血干細胞移植治療，患兒通常于1歲內(nèi)夭折，很少能活過2歲[2]。CID的發(fā)病機制涉及多個基因，包括重組激活基因(recombination activating gene，RAG)1或RAG2、CD3g、鏈相關(guān)蛋白-70(Zeta-associatedprotein-70，ZAP-70)、潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄子(latency associated transcript，LAT)、淋巴細胞酪氨酸激酶(lymphocyte tyrosine kinase，LCK)、雜合CARD11變異(heterozygous dominant negative CARD11 variants)、黏膜相關(guān)淋巴瘤易位基因1(mucosa associated lymphoma translocation genes，MALT1)、白細胞介素(interleukin，IL)-21、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基δ(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit delta，PIK3CD)等[3]。

本文通過回顧分析我院于2020年3月收治的1例CID患兒的臨床資料，探討該患兒的臨床表現(xiàn)及基因變異特點。

1 臨床資料

本研究已通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：FSFY-MEC-2020-065)。患兒，女，2個月，體質(zhì)量5kg。因“發(fā)熱、咳嗽2天”入院，入院后病情加重，進展為重癥肺炎、急性呼吸窘迫綜合征。

1.1 實驗室檢查

血常規(guī)多次提示淋巴細胞絕對值偏低，最低0.95×109/L，外周血CD3+T淋巴細胞絕對數(shù)1.05×109/L，CD3+CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)為0.26×109/L，CD3+CD8+T淋巴細胞絕對數(shù)0.44×109/L，CD4+/CD8+T淋巴細胞絕對數(shù)0.59×109/L，自然殺傷(natural killer，NK)細胞絕對數(shù)2.53×109/L，B淋巴細胞絕對數(shù)0.03×109/L；免疫三項：IgG 481.40mg/L，IgA 3.00mg/L，IgM 122.20mg/L。結(jié)合上述臨床資料，支持CID診斷。氣管插管吸取深部痰液行高通量基因測序檢查，提示PC 949個序列數(shù)，CMV 61 093個序列數(shù)，支持CMV、PC肺炎。

1.2 影像學(xué)檢查

胸片及胸部CT均見雙肺彌散分布磨玻璃密度灶，未見胸腺影，提示胸腺發(fā)育不良，見圖1。

注：患兒胸部正位片(左圖)及胸部CT平掃(右圖)可見雙肺彌散分布磨玻璃密度灶，未見胸腺影，提示胸腺發(fā)育不良。圖1 患兒胸片及胸部CT圖Fig.1 Chest radiographs and chest CT images of the child

1.3 治療結(jié)果

給予更昔洛韋、復(fù)方新諾明聯(lián)合亞胺培南西司他丁、利奈唑胺抗感染，患兒體溫逐漸穩(wěn)定，有創(chuàng)通氣13天后順利撤機，最后病情治愈出院。

為了進一步明確診斷，經(jīng)家長知情同意后，分別抽取患兒及父母外周血2mL，外送基因檢測。提取患兒DNA，并擴增建立含目標(biāo)基因的全外顯子文庫，利用液相捕獲試劑盒捕獲目標(biāo)基因，然后進行高通量測序。這個基因包檢測區(qū)間包括5 177個相關(guān)基因，74 566個編碼區(qū)總共含有12 424 088個堿基。平均覆蓋深度202+/-60X，大于10X覆蓋區(qū)間占99.4%，大于20X覆蓋區(qū)間占99.2%)，找出相關(guān)可能致病基因，用Sanger測序驗證患兒父母相應(yīng)的突變。結(jié)果顯示，患兒RAG1基因存在一處純合子突變c.3074dupT(重復(fù)突變)，導(dǎo)致氨基酸改變p.L1025Ffs*40(移碼突變40位后蛋白翻譯提前終止)，對蛋白功能的影響可能較大。家系驗證父母均為雜合狀態(tài)，患兒為純合狀態(tài)，該突變的遺傳方式為常染色體隱性遺傳(autosomal recessive inheritance，AR)。

根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會聯(lián)合美國分子病理學(xué)會制訂的基因序列變異解釋標(biāo)準(zhǔn)和指南[4]進行致病性分析：c.3074dupT突變?yōu)橐拼a突變，預(yù)測可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成延遲，出現(xiàn)氨基酸的終止密碼；家系驗證父母均為雜合狀態(tài)，患兒為純合狀態(tài)，該突變的遺傳方式為AR；患兒臨床表現(xiàn)與RAG1基因突變導(dǎo)致的相關(guān)基因疾病(細胞體液聯(lián)合免疫缺陷伴肉芽腫、Omenn綜合征和B-型重癥聯(lián)合免疫缺陷)符合。綜上所述，結(jié)合患兒的臨床表現(xiàn)和家系分析，依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會變異分類指南(PMID:25741868)，這個變異為“2類-可能致病”。目前為止，c.3074dupT(p.L1025Ffs*40)這個新型變異沒有在相關(guān)臨床病例中被報道過。患兒及其父母的一代測序圖見圖2、圖3、圖4。

圖2 患兒Sanger測序驗證Fig.2 Sanger sequencing verification of the child

圖3 患兒父親Sanger測序驗證Fig.3 Sanger sequencing verification of the father of the child

圖4 患兒母親Sanger測序驗證Fig.4 Sanger sequencing verification of the mother of the child

患兒肺炎治愈出院后到復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院治療。患兒5個月大時，臍帶血干細胞移植(umbilical cord blood stem cell transplantation，UCBT)成功。移植后最近一次隨訪時間為患兒11個月，正在進行抗排斥和抗感染治療。

2 討論

2.1 RAG1和RAG2是與CID相關(guān)的常見基因，可引起廣泛的臨床和免疫表型

SCID是免疫缺陷最嚴(yán)重的類型，功能性T淋巴細胞和B淋巴細胞發(fā)育受干擾，患兒極易遭受致命性感染。一些患者表現(xiàn)較弱的臨床表型稱為CID[5]。CID發(fā)病涉及多個基因，其中RAG1和RAG2中的亞型突變代表了與CID相關(guān)廣泛的臨床和免疫表型譜的原型[3]，也是與SCID相關(guān)的第二大流行基因[6]。RAG變異發(fā)生率各國報道不一樣，有報道顯示英國的原發(fā)性免疫缺陷(primary immunodeficiency，PID)患者RAG1基因變異占10.56%[7]，在科威特由RAG1/2或DCLRE1C突變引起的可變(variable，V)、多樣性(diversity，D)和連接(joining，J)基因重組缺陷占常染色體隱性遺傳CID的24%[8]。

目前鑒定出RAG1和RAG2致病突變200多種，可引起廣泛的臨床和免疫表型[9]。RAG突變體保留的重組活性與臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度相關(guān)[10]。根據(jù)基因異常對RAG分子活性影響程度的不同，可將RAG缺陷病分為無VDJ重排功能的RAG完全缺陷(重排活性<1%野生型)和低活性VDJ重排功能的RAG殘留缺陷(重排活性>1%野生型)兩大類[11]。雙等位基因RAG1和RAG2突變導(dǎo)致的臨床和免疫表型，包括典型的SCID和Omenn綜合征、泄漏型SCID、遲發(fā)性聯(lián)合免疫缺陷伴肉芽腫和/或自身免疫(CID-G/A)和常見可變免疫缺陷(common variable immunodeficiency，CVID)等[12-13]。然而，RAG缺乏癥患者的基因型與表型相關(guān)性不是絕對的[14]。Al-Herz等人[8]報道的6例具有相同的純合錯義突變RAG1中，5例臨床表型為Omenn綜合征，1例表現(xiàn)為SCID，這可能是由于VDJ重組過程的隨機性加上與環(huán)境因素協(xié)同所致。

2.2 RAG1突變部位與免疫缺陷表型的相關(guān)性

RAG定位于人類染色體11p13,由2個相鄰的基因RAG1和RAG2組成[11]。RAG1和RAG2各由2個外顯子組成，其編碼區(qū)位于第2外顯子中，分別編碼1 043和527氨基酸。RAG1編碼產(chǎn)物Rag1蛋白形成的復(fù)合物是最重要的重組酶之一，Rag1蛋白的核心氨基酸區(qū)域為387～1 008[15]。Rag1蛋白大部分生化和結(jié)構(gòu)表征都是在核心區(qū)域，非核心區(qū)域包括1個與RING-鋅指(RING-ZnF)域相鄰的N末端域(N-terminal domain，NTD)和一個C末端尾巴(C-terminal tail，CTT)[16]，末端的CTT約含有30個氨基酸[17]。本例患兒在第3 074位基因重復(fù)突變，突變導(dǎo)致其編碼蛋白1 025位的氨基酸由亮氨酸變成苯丙氨酸，這一基因突變雖然為純合子突變，但該突變并未導(dǎo)致RAG1編碼蛋白質(zhì)的核心區(qū)域改變，改變位于CTT部，故其編碼產(chǎn)物Rag1蛋白形成的復(fù)合物仍能保留低水平的重組酶活性，未導(dǎo)致病情更為嚴(yán)重的SCID或Omenn綜合征。

2.3 RAG突變導(dǎo)致患者免疫功能異常的機制

在胎兒期胸腺細胞發(fā)育過程中，RAG表達在CD4-CD8-雙陰性(double negative，DN)和CD4+CD8+雙陽性(double positive，DP)階段都發(fā)揮重要作用，而在B細胞發(fā)育的兩個階段亦有相似地表達。RAG的表達異常導(dǎo)致T淋巴細胞、B淋巴細胞的發(fā)育受阻[18]；它可導(dǎo)致T細胞庫多樣性和組成異常，多樣性轉(zhuǎn)化減少導(dǎo)致識別非自身抗原的能力受損，從而導(dǎo)致機體對感染的敏感性增加[3]；RAG缺乏癥影響B(tài)細胞發(fā)育和體內(nèi)平衡，循環(huán)中的B細胞數(shù)量大大減少[19]。在RAG缺陷患者中可觀察到胸腺結(jié)構(gòu)異常[20]。故此類患者容易受到低毒力的條件致病源感染，甚至出現(xiàn)致死性嚴(yán)重感染。

2.4 早期診治CID的重要性

臍血干細胞移植(umbilical cord blood stem cell transplantation，UCBT)是治療RAG突變免疫缺陷兒童的有效方法。盡早接受移植可以提高SCID患兒存活率，在接受移植的免疫缺陷兒童中，移植時年齡小于3.5個月的，其5年生存率為94%，而移植前感染和移植時年齡>3.5個月的兒童則為50%[21]。臨床上CID的發(fā)病率不高，臨床醫(yī)生常常忽視它，因而錯過治療時機。對反復(fù)感染、嚴(yán)重感染、特殊病原體、常規(guī)治療效果差、慢性腹瀉、生長遲緩和(或)有早死家族史的兒童，應(yīng)及早進行臨床免疫功能評價，必要時行基因檢測。早診斷、早移植對提高免疫缺陷兒童的存活率，改善兒童生活質(zhì)量，指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育都具有重要意義。