頂空-氣相色譜法測定吡咯喹啉醌二鈉鹽中殘留溶劑

朱曉玲，周云婷，柴世英

(1.浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠，浙江 新昌 312500；2.新昌縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江 新昌 312500)

0 引言

吡咯喹啉醌(PQQ)是一種陰離子水溶性醌類化合物，將其制備成鈉鹽后可提高其水中的溶解性，PQQ是葡萄糖脫氫酶和乙醇脫氫酶的輔酶。PQQ生理功能獨特且多樣，如具有防護肝損傷、調節機體自由基水平、增強微生物對極端環境的適應力等功能，在食品和醫藥保健領域等方面具有重要的開發前景[1-2]。吡咯喹啉醌二鈉鹽在發酵生產過程中，使用了甲醇、乙醇等有機溶劑，考慮到甲醇未在最后精制步驟使用，本法對甲醇僅進行專屬性的研究，而乙醇則參照人用藥品注冊技術要求國際協調會(ICH)中的要求制定了相應的限度。目前尚未見吡咯喹啉醌中殘留溶劑測定方法的研究，本文通過試驗研究建立了頂空-氣相色譜法測定吡咯并喹啉醌二鈉鹽中的乙醇殘留量檢測方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890N氣相色譜儀，Agilent 5975C頂空進樣器，Agilent DB-624(30 m×0.53 mm，3.0 μm)毛細管柱，FID 檢測器，梅特勒XS205DU 電子分析天平(精度0.01 mg)

1.2 試藥

乙醇、甲醇為分析純，水為純化水。

2 方法和結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent DB-624(30 m×0.53 mm，3.0 μm)毛細管柱；柱溫為程序升溫，起始溫度為40 ℃，保持5 min，以20 ℃·min-1的速率升溫至200 ℃，保持5 min。進樣口溫度為200 ℃，檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID)，溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣，氣體流速為5.0 mL·min-1，分流比為10∶1。頂空進樣，頂空平衡溫度為85 ℃，平衡時間為30 min，定量環溫度為100 ℃，傳輸管溫度為110 ℃，進樣量為1 mL。

2.2 溶液配制

空白溶液：精密取水1 mL，置頂空瓶中，加蓋密封。

供試品溶液：取供試品約50 mg，精密稱定，置頂空瓶中，精密加1 mL水溶解，加蓋密封。

對照品溶液：精密取乙醇適量，用水制成0.25 mg·mL-1的溶液，精密移取該溶液1 mL置頂空瓶中，加蓋密封。

靈敏度溶液：精密移取對照品溶液1 mL，置于50 mL容量瓶中，用水稀釋到刻度，搖勻。精密移取該溶液1 mL置頂空瓶中，加蓋密封。

2.3 專屬性考察

精密移取甲醇、乙醇各0.5 μL，分別置于頂空瓶中，各用水1 mL稀釋，搖勻，加蓋密封，作為甲醇、乙醇定位溶液；另取供試品約50 mg，精密稱定，置于頂空瓶中，再精密加入甲醇、乙醇各0.5 μL，用水1 mL稀釋，搖勻，加蓋密封，作為混合溶液。取上述甲醇定位溶液、乙醇定位溶液、混合溶液及2.2項下的空白溶液、對照品溶液和供試品溶液，按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，結果如圖1所示。結果表明空白溶液及甲醇對檢測無干擾，甲醇與相鄰峰(乙醇)的分離度大于1.5，說明該檢測方法專屬性好。

圖1 專屬性圖譜

2.4 檢測限和定量限考察

取2.2項下的對照品溶液，逐步稀釋，精密取1 mL置頂空瓶中，加蓋密封，分別作為檢測限溶液和定量限溶液；按照2.1項下的色譜條件進行測定，其中檢測限溶液測定3次，定量限溶液測定6次，分別記錄乙醇峰的信噪比(S/N)平均值。以信噪比大于3∶1時測得的濃度為檢測限，以信噪比大于10∶1時測得的濃度為定量限。方法考察的檢測限和定量限溶液濃度分別為1 μg/mL和5 μg/mL，分別相當于供試品溶液濃度水平的0.002%和0.01%，說明該方法的靈敏度高。結果如表1所示。

表1 檢測限及定量限試驗數據

2.5 線性關系考察

精密取乙醇適量，用水制成0.5 mg·mL-1的溶液，作為線性儲備溶液；分別精密量取線性儲備溶液適量，用水逐步稀釋制成質量濃度分別為 0.005、0.025、0.100、0.200、0.250、0.375 mg·mL-1的溶液。精密移取上述系列濃度溶液及線性儲備溶液各1 mL，分別置于頂空瓶中，加蓋密封，每個溶液平行封蓋3份。按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以質量濃度為橫坐標，乙醇峰面積平均值為縱坐標，計算回歸方程，結果表明乙醇在0.005～0.500 mg·mL-1濃度范圍內，回歸方程為Y=2 553.8X-6.9，相關系數為0.999 04。說明該方法在規定的質量濃度范圍內線性關系良好。

2.6 精密度試驗

取2.2項下的對照品溶液10份，每份1 mL，至頂空瓶中，加蓋密封，按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖。乙醇峰面積的RSD為5%(n=10)。方法精密度良好。

2.7 重復性試驗

按2.2項下供試品溶液的配制方法平行配制供試品溶液6份，同時取對照品溶液2份，按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結果按外標法以峰面積計算，乙醇殘留量(%)的RSD為4%(n=6)，方法重復性好。

2.8 加樣回收率考察

取已知殘留溶劑量的樣品(批號160402)共9份，每份約50 mg，精密稱定，分別置頂空瓶中，3份1組。3組分別依次加2.5 項下 0.005 mg·mL-1、0.250 mg·mL-1、0.500 mg·mL-1濃度溶液各1 mL溶解，加蓋密封，按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，計算回收率。結果如表2所示，結果表明該方法的準確度較高，適用于吡咯喹啉醌二鈉鹽的乙醇殘留檢測。

表2 回收率試驗結果(n=9)

2.9 樣品測定

取3批樣品，按照2.2項下的供試品溶液的配制方法平行配制2份，同時取對照品溶液2份，按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結果按外標法以峰面積計算。結果如表3所示，結果表明各批次樣品的檢測結果均小于定量限(0.01%)。

表3 樣品殘留溶劑測定結果

3 結語

結合ICH Q3C(R6)Guideline for Residual Solvents中乙醇殘留量的限度控制要求(0.5%)，綜合本文的檢測限、定量限研究結果，該方法的靈敏度溶液濃度設定為0.01%。

該方法經過專屬性、檢測限、定量限、線性、精密度、重復性及加樣回收率考察，結果表明該方法操作簡便，靈敏度高，檢測結果精密、準確、可靠，可用于吡咯并喹啉醌二鈉鹽原料藥中乙醇殘留量的測定。