微生物胞外多糖的提取與應用研究進展

王蓓蓓 張偉 周曉倫

摘 要：隨著科學研究的不斷深入與提取技術的提高，近年來對多糖生物學功能的認識有了量的提升和質的飛躍，多糖的生物學功能涉及免疫、癌變、腫瘤和衰老等方面，可以應用于食品、醫藥、農業、污水處理等領域。該文對多糖的定義、分類、生物合成和多糖的提取方法進行了概述，重點闡述了高壓脈沖電場技術、超臨界流體萃取法、雙水相萃取法。雖然對微生物多糖的研究仍在不斷深入，但微生物多糖真正的應用價值尚未得到實現。目前，胞外多糖已經作為食品添加劑運用到食品工業中，除此之外多糖還可用于制備抗腫瘤新藥或疫苗、抗凝血等應用。

關鍵詞：微生物胞外多糖;提取方法;生物合成;超臨界流體萃取法

中圖分類號 Q539 ? 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2021）18-0021-03

Research Progress on Extraction and Application of Microbial Extracellular Polysaccharides

WANG Beibei1 et al.

（1Baishui Central Health Center， Pingliang 744000， China）

Abstract： With the continuous development of scientific research and the improvement of extraction technology， researchers in recent years on the biological function of polysaccharide understanding has a quantity of improvement and qualitative leap， involving immunity， cancer， tumor and aging and other aspects， can be applied to food， medicine， agriculture， sewage treatment and other fields. This article gives a detailed overview of the definition， classification， biosynthesis and extraction methods of polysaccharides， with emphasis on high-voltage pulsed electric field technology， supercritical fluid extraction， and aqueous two-phase extraction. Although the research on microbial polysaccharides continues to deepen， the true application value of microbial polysaccharides has not been realized. At present， extracellular polysaccharides have been used as food additives in the food industry. In addition， polysaccharides can also be used to prepare new anti-tumor drugs or vaccines.

Key words： Microbial Exopolysaccharide; Extraction method; Biosynthesis; Supercritical fluid extraction

1 多糖的定義與分類

多糖（Polysaccharide）屬于典型的糖類物質，其分子結構十分龐大而且復雜，是由多個單糖分子失水與縮合構成，為典型的聚合糖高分子碳水化合物，由至少4個單糖并通過糖苷鍵進行結合。微生物細胞外多糖，則是微生物在繁殖過程中分泌至細胞之外的多糖高分子碳水化合物，或者產生莢膜多糖，與微生物細胞壁粘連，或分泌游離到微生物細胞壁外形成粘液多糖[2]。

按照多糖生成物種來源，可以將多糖分為微生物、動物與植物多糖;按照所處微生物細胞位置，可以將其微生物多糖進一步分為細胞外、細胞內、細胞壁多糖。細胞外多糖又可以按照單糖的構成模式分為同型與異型多糖[3]。

2 微生物胞外多糖的合成

微生物胞外多糖（Exopoly Saccharides，EPS）是原核細胞型生物和真核細胞型生物等在生長繁殖過程中產生的對其自生有保護作用的聚合物。微生物胞外多糖的生物合成受到多種因素的影響，如溫度、氫離子濃度指數、溶氧量、培養基中營養物質比例、裝液量等。部分微生物在其成長的全過程中均能分泌胞外多糖（EPS），而有些微生物只能在對數期或穩定期才產生細胞外多糖。較高的碳氮比、較低培養溫度、營養不平衡、非生物脅迫的環境條件等均有利于細胞外多糖的合成和產生。如微生物細胞外多糖的產生需要在高碳氮比，而糖原的產生也需要高碳氮比，因此兩者相互競爭。

微生物細胞外多糖生成菌種類較為豐富，也有著頗為廣泛的分布，現有報道主要為：醋酸桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、假單胞菌屬、芽胞桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、酵母菌屬、雙歧桿菌等，其中部分菌株多糖結構與表型都已經得到明確[4]。在G+菌和G-菌中，細胞外多糖的合成過程十分復雜，包含細胞外多糖合成酶的種類，合成酶在細胞內外的移動和胞內多糖與胞外多糖的轉變。細胞外多糖的合成主要分為以下幾個步驟[5]：（1）在微生物中，實行單糖活化和糖核殼體轉變;（2）通過糖基轉移酶（Glycosyl Transferase）將單糖的重復單元連接在脂類載體（Wzx/Wzy）行成多糖;（3）運輸單糖穿過管道狀脂類載體（Wzc/Wzb/Wza）;（4）多糖聚合物（EPS）分泌至細胞表面。

3 胞外多糖的提取方法

在提取發酵液中微生物胞外多糖時，要依次經歷去除微生物菌體、多糖提取、多糖干燥等階段。去除微生物菌體采用高速離心或濾膜過濾等，多糖提取一般可以分為鹽沉淀法和有機溶劑沉淀法，多糖干燥是烘干胞外多中液相成分。

3.1 鹽沉淀法 鹽沉淀法是利用多糖結合化合物產生絮狀沉淀而析出的原理。如十六烷基吡啶（CPC）和季銨鹽十六烷基三甲基銨的溴化物（CTAB）能與酸性多糖形成不溶于水的聚合體，分離出的多糖沉淀再利用鹽溶液或有機物溶解聚合體，采用滲析等方法除去聚合體中CPC和CTAB。

3.2 有機溶劑沉淀法 有機溶劑沉淀法是水溶性多糖的常用提取方法，因為水溶性多糖溶于水而不溶于有機物的特質，在水溶性多糖中加入2倍體積以上的有機物，使多糖形析出，常用的有機物有乙醇、異丙醇和丙酮。此法操作簡單，能把發酵液中的大部分水溶性多糖都沉淀出來，但其中有少量的雜質，需純化，費用消耗較高。

3.3 高壓脈沖電場技術（Pulsed Electric Field，PEF） 由于微生物細胞膜會存在磷脂與蛋白質，它們都攜帶一定的電荷，在10～50kV/cm2的電場環境中，會使得細胞膜兩側異性電荷相互吸引，進而對膜體產生擠壓效應，而攜帶電荷物質將會向兩極迅速移動，于是就會形成膜電穿孔效應，細胞內容物開始被溶出。PEF技術的優勢體現在整個過程中不會生成熱量，可以對提取物進行很好保護，不會產生熱降解[6-7]。張鐵華等以西藏靈菇發酵液為材料，通過高壓脈沖電場技術提取胞外多糖，發現優化高壓脈沖電場條件提取乳酸菌胞外多糖的質量濃度比對照組的提高84.30%，且用時短、效率高[8]。張玉等以羊肚菌菌絲為研究對象，借助PEF法對其體胞中的多糖發酵液進行提取，利用響應面法，對電場強度、脈沖數和液料比值進行優化，得到最佳條件為：電場強度18kV/cm、脈沖數7、液料比值27mL/g，此時多糖的得率達到最大值，為56.03μg/mL[9]。

3.4 超臨界流體萃取法 超臨界流體萃取技術（SFC）是近些年得到創新發展的提取技術，其萃取劑為超臨界狀態下的流體，然后從固相或者液相中對其中有效構成進行萃取。當前使用較為常見的是二氧化碳[10]。李燁等采用超臨界二氧化碳流體對灰樹花多糖進行了提取，提取率為53.18%，并發現夾帶劑濃度對灰樹花多糖的超臨界CO2提取工藝有顯著性影響[11]。楊孝輝等使用這種超臨界CO2對淮山多糖進行提取，通過響應面法優化了萃取工藝，發現超臨界二氧化碳流體萃取淮山多糖萃取得率為（0.2807±0.0045）%，與預測值0.287%接近[12]。王大為等采用超臨界二氧化碳流體萃取技術研究其對蒙古口蘑多糖提取率的影響，結果表明，萃取率為2.06%，與溶劑處理和未處理試樣相比提取率分別為4.2倍、1.8倍[13]。目前，運用超臨界流體萃取法提取微生物多糖還是比較少的，大多數都是用于天然植物和藥物的提取。

3.5 雙水相萃取法 雙水相體系是指雙高聚物雙水相體系，其原理是由于高聚物分子的空間阻礙作用，不能相互滲透形成均一相，從而具有分離傾向，在一定條件下可分為二相[14]。劉琳等利用乙醇/碳酸鉀雙水相體系對樺褐孔菌發酵培養物中的多糖進行萃取分離，經過優化條件，多糖提取率達（98.34±0.83）%。該方法能夠同步有效地分離樺褐孔菌發酵培養物中的多糖，且其蛋白質和菌體的去除效果好，具有一定的工業應用前景[15]。

4 微生物胞外多糖的應用研究

在現代科技持續發展下，再加上不同學科的交叉融合，研究人員開始對多糖及其復合物的生物活性與化學結構進行深入研究。雖然微生物多糖研究日益深入，然而真正實現工業化生產還十分鮮見，微生物多糖的價值并未得到很好的體現。如今，已經被批準規模化生產的細胞外多糖主要有結冷膠、黃原膠等[16]。

4.1 在食品中的應用 如今，很多種多糖都已經在食品加工業中得到使用，其中黃原膠的應用更是廣泛，它為典型的乳化品、增調品等。黃原膠是基于黃單胞桿菌，并借助于發酵而生成的微生物酸性雜多糖，已經被美國食藥管理（簡稱FDA）批準，并用作食品添加劑。黃原膠以其優異、獨特的理化特性和食用安全性，可作為增稠劑、乳化劑、懸浮劑等在乳及乳制品、飲料制品、烘烤食品、糧食及糧食制品、調味品及冷凍飲品等領域中得到了廣泛的應用，以此增強食品的穩定性和提高食品的品質[17]。

4.2 在醫藥中的應用 已報道從不同生物中分離出多種擁有抗腫瘤活性的多糖，進而應用于相關抗腫瘤藥物的制備，或者為疫苗的研發提供支持。鐘閏等研究發現，杜氏鹽藻胞外多糖（DsEPS）可抑制Hela細胞增殖，降低細胞活力，改變細胞形態，表明DsEPS有抗腫瘤活性，并初步探明了其抗腫瘤機制，今后進一步研究多糖抗腫瘤提供有效參考[18]。劉城移等研究表明，蟬蟲草Cordyceps cicadae的胞內和胞外多糖均可極顯著抑制HepG-2細胞活性（P<0.01），半數抑制濃度（IC50）值分別為3.23、0.45mg/mL，細胞遷移率分別為38.72%、24.79%，提示胞外多糖比胞內多糖具有更強的抗肝癌細胞HepG-2活性[19]。馬文錦等對膠紅酵母胞外多糖組分（Rhodotorula mucilaginosa exo-polysaccharide2-A，REPS2-A）抑制10種常見癌細胞能力進行了篩選，結果表明，胞外多糖組分REPS2-A能有效抑制肝癌細胞的增殖，使肝癌細胞HepG2阻滯發生在G1/S期，并誘導肝癌細胞HepG2凋亡，且存在劑量效應[20]。李輝等研究發現，雙歧桿菌RH的不同質量濃度EPS可以顯著延長活化部分凝血活酶時間（APTT）和凝血酶時間（TT）。說明EPS具有一定的抗凝血活性，并且抑制凝血酶介導的纖維蛋白的形成來發揮抗凝血功效[21]。

在環境領域，一些胞外多糖具有絮凝能力，并能夠吸附重金屬，可作為生物絮凝劑在污水處理方面發揮作用。關志國等研究了紅球菌HX-2所產胞外多糖對水體中Cu2+的吸附作用，發現通過等溫吸附模型擬合得到HX-2胞外多糖對Cu2+的最大吸附量為144.93mg/g，其對Cu2+具有良好的吸附作用，可用于工業廢水中重金屬離子的處理[22]。除此之外，胞外多糖在其他方面也有應用，如在農業方面，在Cd脅迫條件下的水稻幼苗經過屎腸球菌胞外多糖處理后的內類黃酮與花色素苷的含量提高18.6%～208.7%，超氧化物歧化酶、過氧化物酶的活力顯著上升，丙二醛含量顯著下降[23]。胞外多糖在幫助植物抵抗干旱，促進植物幼苗生長方面有著較大的作用。隨著國內外不斷對胞外多糖研究的發展，相信其應用范圍會越來越廣泛。

5 總結與展望

多糖作為一種天然活性大分子物質，是基本的生命物質之一，存在極為特殊的生物學功能，在食品、藥物研制和生物制品等方面的發展前景非常好。提高胞外多糖萃取率的關鍵在于微生物表面多糖的溶解量，通過萃取劑、高壓脈沖以及超聲波等手段加速微生物表面多糖溶解，利于多糖萃取。微生物胞外多糖在營養缺乏、高光誘導、高鹽脅迫、低溫培育、重金屬離子誘導等環境脅迫條件下，會適應性地向胞外發酵培養基環境中分泌大量的胞外多糖（EPS）。胞外多糖生物活性顯著，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤和提高免疫功能等多重生物活性，醫學臨床應用前景十分廣闊。微生物胞外多糖在食品業的應用已經非常廣泛，在創造經濟的同時提高了食品的品質。

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（責編：張宏民）