無機鹽種類與用量對AMEP蛋白表達水平的影響

萬恒東 岳文濤 趙鋒 商憲富 陳道文 王思文 孫明超 劉權

摘 要：AMEP蛋白是從枯草芽孢桿菌中分離鑒定出來的一種新型蛋白激發子，能夠誘導植物防衛反應并提高植物的抗病性，是生物農藥的理想候選。在前期的研究中發現，培養基中的無機鹽對AMEP蛋白表達水平有很大影響。為了最大限度地提高AMEP蛋白的產量，通過在AMEP蛋白的發酵培養基中添加多種無機鹽，研究不同種類的無機鹽對AMEP蛋白表達水平的影響。結果表明，磷酸鈣和磷酸氫二鈉能顯著提高AMEP蛋白的表達水平，而氯化鈉、氯化鈣、硫酸鋅則顯著降低了AMEP蛋白的表達水平。當磷酸鈣用量為2g/L時，AMEP蛋白表達產量最高。

關鍵詞：AMEP;無機鹽;蛋白產量;磷酸鈣;氯化鈉

中圖分類號 Q936? 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）18-0024-03

Effects of Inorganic Salts on the Expression of AMEP Protein

WAN Hendong1 et al.

（1Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing163300， China）

Abstract： AMEP protein is a new Protein Elicitor isolated from Bacillus subtilis. It can induce plant defense response and improve plant disease resistance. It is an ideal candidate for new biological pesticides. In the previous study， it was found that the inorganic salts in the medium had a great influence on the expression level of AMEP protein. In order to maximize the production of AMEP protein， the effects of different inorganic salts on the expression of AMEP protein were determined by adding a variety of inorganic salts to the culture medium of AMEP protein. The results showed that calcium phosphate and disodium hydrogen phosphate significantly increased the expression level of AMEP protein， while sodium chloride， calcium chloride and zinc sulfate significantly decreased the expression level of AMEP protein. It was found that the expression yield of AMEP protein was the highest when the dosage of calcium phosphate was 2g/L.

Key words： AMEP; Inorganic salt; Protein yield; Calcium phosphate; Sodium chloride

在我國，常采用施用化學農藥的方式來防治農作物病害，以保障農作物的產量與質量。然而，大量施用化學農藥不僅會破壞耕種土地的土壤生態環境，而且有害生物的抗藥性也會因此而增強[1-2]，因此近年來生物農藥的研究逐漸成為熱點。蛋白激發子是來自于微生物的一類蛋白質，可與植物細胞表面相應的受體特異性結合，誘導植物發生防衛反應[3]，提高植物的抗病能力，被視為生物農藥的理想候選。

AMEP蛋白是從芽孢桿菌中分離出來的一種新型蛋白激發子，包含76個氨基酸殘基，其相對分子質量為8.36kDa[4]?，F有研究表明，AMEP蛋白可以與植物相互作用并引起一系列的防衛反應，該蛋白兼具拮抗植物病原菌和殺傷有害昆蟲的功能[5-6]，可將其用于生物防治來保障植物的健康生長，是蛋白類生物農藥的理想材料[7]。

在AMEP蛋白的前期鑒定過程中，研究者分別使用LB培養基和YME培養基對枯草芽孢桿菌進行培養，結果顯示，使用LB培養基進行培養時無法檢測到AMEP的表達，而使用YME培養基進行培養時AMEP蛋白表達水平顯著提升。經過比較，2個培養基的主要差別為YME培養基中不含有氯化鈉，說明氯化鈉抑制了蛋白表達。已有研究表明，培養基中無機鹽的種類與用量會影響到微生物的發酵產量[8]，因而需要對培養基中無機鹽的種類和用量進行深入，以提高AMEP蛋白的表達水平。

本研究以YME培養基為基礎，添加不同種類的無機鹽，探討其對AMEP蛋白表達水平的影響，以確定最適無機鹽的種類;并對最適無機鹽的用量進行梯度優化，確定最適無機鹽用量，旨在為提高AMEP蛋白的產量提供科學依據。

1 實驗材料

本實驗所用菌株為枯草芽孢桿菌BU412，由本實驗室分離鑒定并保存于中國模式菌種收集中心（CCTCC M2016142），用于AMEP蛋白的表達。

YME培養基：麥芽糖10g/L、酵母提取物4g/L、葡萄糖4g/L、pH7.2，用于枯草芽孢桿菌BU412的菌株培養。低鹽緩沖液：20mM Tris–HCl（PH7.5），高鹽緩沖液：20mM Tris–HCl 1M NaCl（PH7.5），用于AMEP蛋白的純化。

本次試驗所用到的無機鹽為氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、磷酸鈣、硫酸鋅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，均為分析純試劑。

2 實驗方法

2.1 無機鹽種類的篩選 挑取枯草芽孢桿菌BU412的單菌落進行接種至100mL的YME液體培養基中，在32°C、160r培養12h。按1∶100的比例，分別將3mL的種子液接入300mL的YME液體培養基中，共8瓶。這8瓶培養基中分別含有不同種類的無機鹽，分別為氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、磷酸鈣、硫酸鋅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，各無機鹽的用量均為1g/L。隨后對上述培養基進行培養，在32°C、160r條件下培養22h。

將培養完成的枯草芽孢桿菌BU412于4℃條件下16000g離心15min，獲得培養液上清。將上清液通過0.22μM的濾膜過濾，用于蛋白質純化。蛋白質純化采用的是AKTA Purifier蛋白純化儀，先用低鹽緩沖液預平衡5ML的Hitrap Q hp的陰離子交換柱，之后將上清液上樣加入陰離子交換柱上，流速為1mL/min。上樣完成后，使用3倍柱體積的低鹽緩沖液進行平衡，使用40%的高鹽緩沖液進行洗脫，并收集蛋白樣品。離子交換純化后的蛋白經過截留體積為30kDa的超濾管進行進一步除雜，除去小分子量的雜蛋白，截留的蛋白樣品即為AMEP蛋白。

使用紫外微量分光光度計Nanodrop對純化后的AMEP蛋白進行濃度測定，經換算得到AMEP蛋白的表達產量。以AMEP蛋白的表達量為參考指標，篩選出最適無機鹽的種類。

2.2 無機鹽濃度的篩選 在確定最適的無機鹽后，按2.1中所述的方法條件培養枯草芽孢桿菌，改變YME培養基中無機鹽的濃度（0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L），在32°C、160rpm條件下培養22h，收集菌體。參照2.1所述方法分離純化AMEP蛋白并檢測蛋白濃度，得到AMEP蛋白的表達產量。以AMEP蛋白的表達量為參考指標，篩選出無機鹽的最佳濃度。

3 結果與分析

3.1 無機鹽種類對AMEP蛋白產量的影響 利用Origin 8.5對通過紫外微量分光光度計檢測得到的AMEP蛋白表達產量進行數據分析并繪制方差柱形圖。在使用不同的無機鹽對BU412菌株培養的條件下，菌株發酵生產AMEP蛋白的表達水平如圖1所示，磷酸鈣和磷酸氫二鈉能顯著提高AMEP蛋白的表達水平;磷酸二氫鈉和氯化鉀的AMEP蛋白表達水平與空白對照組無顯著差異;氯化鈉、氯化鈣、硫酸鋅和氯化鎂則顯著降低AMEP蛋白表達水平。以上結果說明無機鹽種類對AMEP蛋白產量影響較大，尤其是一些無機鹽的存在會極大地限制AMEP蛋白的表達，今后在AMEP蛋白的表達過程中要注意避免使用此類無機鹽。由于磷酸鈣和磷酸氫二鈉都會顯著提高AMEP蛋白的表達水平，但由于兩者相比，磷酸鈣效果更加顯著，因此確定最適無機鹽為磷酸鈣，后續的最適無機鹽用量也在此基礎上進行。

3.2 最適磷酸鈣的用量 在確定磷酸鈣為最適無機鹽后，本文對培養基中磷酸鈣的最適用量進行了篩選。經過蛋白純化和濃度測定，制作柱形圖，得到AMEP蛋白的表達水平如圖2所示。由圖2可知，磷酸鈣的用量小于2g/L時，AMEP蛋白的表達量會隨著磷酸鈣用量的增加而升高;當磷酸鈣的用量為2g/L時，AMEP蛋白表達量達到最大;而當磷酸鈣的用量大于2g/L時，AMEP蛋白表達量會逐漸下降。由此確定，AMEP蛋白表達培養基中的磷酸鈣最適用量為2g/L。

4 討論

已有研究表明，菌株發酵除受到發酵條件的限制外，培養基的組成也是一個至關重要的影響因素[10]。無機鹽是微生物生長和代謝不可或缺的重要營養成分[11]，其具有構成菌體細胞成分，作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑，調節培養基的滲透壓、pH，氧化還原電位等作用。盡管微生物對于無機鹽的需求量很少，但是在發酵過程中有可能會因為無機鹽的種類以及無機鹽的用量而不能滿足菌體的生長以及代謝產物的要求，從而影響到微生物的發酵產量[12]。本次實驗的目的是探究培養基中無機鹽的種類及用量對AMEP蛋白表達產量的影響。

在添加的無機鹽為磷酸鈣時，AMEP蛋白的表達產量表現為最高;在添加的無機鹽為氯化鉀、磷酸氫二鈉時，AMEP蛋白的表達產量與空白對照組相似;在添加的無機鹽為氯化鈉、硫酸鋅、氯化鈣和氯化鎂時，AMEP蛋白的表達產量均顯著低于空白對照組。值得注意的是，在培養基中加入氯化鈉時，AMEP蛋白的表達量最低，解釋了之前的研究中使用LB作為培養基進行發酵無法得到AMEP蛋白。這些結果說明不同種類的無機鹽對AMEP蛋白表達產量的影響各不相同[13]，且用于發酵生產AMEP蛋白的最適無機鹽為磷酸鈣。

由相關研究可知，磷是微生物生長代謝活動中的重要元素，既參與了磷脂、核酸以及多種輔酶的構成，也在代謝調節方面發揮著重要作用。而在微生物發酵中鈣離子主要參與細胞調節細胞的生理狀態，具有降低細胞膜的通透性、維持細胞的膠體狀態的作用[14]。磷酸鈣可能在AMEP蛋白外分泌表達過程中的蛋白誘導表達信號通路和細胞膜通透方面起到了促進作用，在一定程度上解釋了為何磷酸鈣可以顯著提高AMEP蛋白表達產量。

據相關研究表明，無機鹽的用量表現為在適當濃度范圍時，會提高蛋白的表達水平;當使用的無機鹽用量不在此類無機鹽用量的最適濃度范圍內時，仍會對蛋白的表達水平產生影響，但影響的程度均會小于此類無機鹽最適用量對蛋白表達水平的影響[15]。雖然磷酸鈣對AMEP蛋白的表達具有促進作用，但其用量也不是越大越好，經實驗確定最適用量為2g/L。此研究結果可為今后提高AMEP蛋白的表達水平提供參考。

5 結論

本研究通過探討培養基中無機鹽的種類及用量對AMEP蛋白表達水平的影響，最終確定了發酵生產AMEP蛋白的最適無機鹽為磷酸鈣，其最適用量為2g/L。這一結果將為最大限度地提高AMEP蛋白的表達水平以及將AMEP蛋白相關產品應用于植物病蟲害防治提供了科學依據。

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（責編：張宏民）