血管緊張素-（1-7）通過抑制活性氧激活的p38MAPK通路對抗阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞損傷

孫玉會，劉旭麗

（上黨區人民醫院，山西 長治 047100）

0 引言

心肌病（CM）是一組由于心臟下部分腔室（即心室）的結構改變和心肌壁功能受損所導致心臟功能進行性障礙的病變。阿霉素（ADR 或DOX）是一種蒽環類抗腫瘤藥物，因其對很多腫瘤均有較好的療效，所以被廣泛應用于臨床。然而，其具有嚴重的心臟毒性[1-3]。p38MAPK 作為MAPK 家族中的一個重要成員，主要被環境應激及細胞因子激活，主要參與調節細胞的生長、分化、分裂以及死亡[4-5]。

血管緊張素-（1-7）[Ang-（1-7）]自1983 年在大鼠腦組織中被發現以來，從被認為是無活性的代謝片段到目前越來越多的生理及病理效應被發現，特別是在心血管系統的作用被許多學者重視[6]。本文應用DOX 損傷H9c2 心肌細胞，為深入闡明Ang-（1-7）的心肌保護作用提供新的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

血管緊張素-（1-7）、N-acetyl-L-cysteine（NAC）、阿霉素、Hoechst 33258、雙氯熒光素（DCFHDA）和羅丹明123（Rh123）購自Sigma Aldrich 公司（USA），細胞計數試劑盒8（CCK-8）由Dojindo Lab（日本）提供，蛋白預覽Marker（10-170Kd）購自Fermenta 公司，DMEM-F12 培養基以及特級胎牛血清（FBS）購自Gibco BRL（USA），抗t-p38、p-p38抗體及SB302580（p38MAPK 抑制劑）購自Cell Signaling Technology Inc（CST）。

1.2 細胞培養和分組

H9c2 細胞來源于大鼠胚胎期心臟組織。在37 ℃、5%CO2的條件下，培養于含有10% 胎牛血清的DMEM-F12培養基中。

實驗分為8 組：①正常對照組；②阿霉素損傷組；③血管緊張素-（1-7）預處理+阿霉素損傷組：10-3μmol/L Ang-（1-7）作用H9c2 心肌細胞2 h，撤去，用PBS 洗兩2 次，接著5 μmol/L DOX 作用24 h；④SB203580 預處理+阿霉素損傷組：5 μmol/L SB203580 作用H9c2 心肌細胞60 min，撤去，用PBS 洗2 次，接著5 μmol/L DOX 作用24 h；⑤NAC 預處理+阿霉素損傷組：1000 μmol/L NAC 作用H9c2 心肌細胞60 min，撤去，用PBS 洗2 次，接著5 μmol/L DOX 作用24 h；⑥血管緊張素-（1-7）處理組：10-3 μmol/L Ang-（1-7）作用H9c2 心肌細胞2 h；⑦SB203580 處理組：5 μmol/L SB203580作用H9c2 心肌細胞60 min；⑧NAC 處理組：1000 μmol/L NAC 作用H9c2 心肌細胞60 min。

1.3 Western blot 測定p38MAPK 蛋白的表達

大鼠H9c2 心肌細胞接種于60 mm 培養皿中，各實驗組給予不同的處理因素后，用預冷的PBS 洗3 次，加入細胞裂解液60 mL，4 ℃冰箱中靜置30 min，12000 r/min 離心10 min，取上清，采用BCA 法進行蛋白定量。總蛋白經SDSPAGE 分離后，轉移到PVDF 膜上。用5% 脫脂奶粉封閉90 min，隨后加入抗p-p38MAPK 抗體（1:1000）、抗t-p38MAPK 抗體（1:1000），4 ℃冰箱中過夜，用TBST 洗3 次，10 min/ 次。將PVDF 膜用發光試劑ECL 顯色，暗室曝光到X 線片上，凝膠成像系統掃描分析結果。

1.4 CCK-8 測定心肌細胞存活率

大鼠H9c2 心肌細胞接種于96 孔培養板中，當細胞生長到培養孔約80%面積時，根據實驗需要進行不同的處理；每個處理因素設5 個復孔。終止培養后，每孔加入10 μl CCK-8，輕搖，37 ℃孵育2.5 h，用酶標儀（λ=450 nm）記錄各孔的吸光度（OD）。取5 孔OD 值的平均數，按下列公式計算心肌細胞存活率：細胞存活率（%）=處理組OD/ 對照組OD×100%，重復3 次。

1.5 Hoechst33258 核染色法測定細胞凋亡

將大鼠H9c2 心肌細胞接種于24 孔培養板中，在細胞生長到占培養孔面積大約80%時，上述各實驗組不同的處理因素后，棄去培養基，PBS 沖洗3 次，然后用4% 多聚甲醛于4 ℃環境中固定15 min，PBS 沖洗3 次，加入含5 mg/L Hoechst33258 試劑，于37 ℃溫箱孵育15 min，然后用PBS沖洗3 次。在熒光顯微鏡下（TE-2000’ Nikon’ Japan）攝片，染色質呈均勻分布，核被染成均勻藍色的細胞被認為是正常的心肌細胞，如細胞核呈濃縮、碎裂的明亮藍色細胞則被認為是凋亡的心肌細胞，隨機選取視野在熒光顯微鏡下攝片。重復3 次。

1.6 心肌細胞胞內ROS 水平的測定

細胞內的ROS 可將無熒光的DCFH 氧化成發出綠色熒光的DCF。綠色熒光的強弱可以間接反映細胞內ROS 的水平。將賴氨酸包被的蓋玻片置于12 孔培養板內，H9c2 心肌細胞被均勻地接種于蓋玻片上。當細胞生長到培養孔約80%面積時，根據實驗需要給予相應的處理。每組均包括3個復孔。處理完成后，用PBS 漂洗蓋玻片3 次，用10 μmol L-1DCFH-DA 染液于37 ℃孵育30 min。在熒光顯微鏡下隨機選取5 個不重復區攝片，用Image J 1.47i 軟件分析5 個視野綠色熒光強度的平均值，再對每組的各樣本進行統計分析。

2 結果

2.1 Ang-（1-7）減弱DOX 對p38MAPK 表達的上調作用

單獨10-3 μmol/L Ang-（1-7）處理心肌細胞2 h 對p-p38MAPK 的基礎表達無明顯的影響，見圖1。

圖1 Ang-（1-7）減弱DOX 對H9c2 心肌細胞p-p38MAPK 的上調作用

2.2 Ang-（1-7）、p38MAPK 通路抑制劑和NAC 拮抗DOX 引起的心肌細胞毒性

單獨的10-3μmol/L Ang-（1-7）、5 μmol/L SB203580 或者1000 μmol/L NAC 作用H9c2 細胞對心肌細胞存活率無明顯影響，見圖2。

圖2 Ang-（1-7）、p38MAPK 通路抑制劑和NAC 抑制DOX 引起的心肌細胞毒性

2.3 Ang-（1-7）、p38MAPK 通路抑制劑和NAC 減輕高糖引起的心肌細胞凋亡

Hoechst 33258 染色的結果（圖3）顯示，單獨的10-3μmol/LAng-（1-7）、5 μmol/L SB203580 或 者1000 μmol/L NAC 作用H9c2 細胞本身不引起細胞凋亡。

圖3 Ang-（1-7）、p38MAPK 通路抑制劑和NAC 減輕高糖引起的心肌細胞凋亡

3 討論

阿霉素性心肌病是由于阿霉素誘導的心肌細胞損傷所致，心肌毒性是阿霉素危害最大，嚴重限制了阿霉素的臨床應用，其中阿霉素誘導的心肌毒性主要機制有氧化應激和細胞凋亡，為了找到更特異和高效的防治措施，深入研究阿霉素引起心肌毒性的發病機制十分必要[7-8]。本研究結果顯示，阿霉素可以激活p38MAPK，采用ROS 清除劑NAC 后可以抑制阿霉素誘發的p38MAPK 的磷酸化；這些實驗數據提示：ROS 介導了阿霉素激活的p38MAPK 信號通路的激活。

綜上所述，本文證實Ang-（1-7）能保護H9c2 心肌細胞對抗DOX 引起的心肌毒性，此保護作用可能與其對抗ROS激活的p38MAPK 通路從而發揮其抗氧化作用、線粒體保護及抗凋亡作用等有關。Ang-（1-7）是具有廣泛生物學活性的內源性血管緊張素，具有顯著的心肌保護作用，但其機制尚未明了，值得我們繼續探索。