miR156介導SPLs參與調控擬南芥種子成熟過程

張小乙，韓 雪，李紅雪，王晶瑩，王守文，翟璐璐

（吉林大學植物科學學院，吉林 長春 130062）

【研究意義】種子不僅是植物生命的起始，也是人類賴以生存的最基本食物及禽畜飼料的來源。高等植物的種子發育過程可分為兩個主要階段：胚和胚乳的形態建成以及種子成熟［1］，其中種子成熟是一個特異、復雜的發育過程，起始于心型胚的形成，經歷胚的生長與膨大填充、貯藏物質（主要包括貯藏蛋白、脂類和碳水化合物等）及ABA的積累、種子脫水與休眠等過程，終止于種子干燥期結束。種子成熟是種子發育的重要階段，不僅是決定種子質量和產量的重要時期，還是影響種子貯藏和質量保存的關鍵環節，因此，越來越多的科研人員將目光投向植物種子成熟的相關研究領域。盡管人們對種子成熟調控網絡有一定認識，但全面揭示這種調控網絡還需挖掘更多的關鍵因子。

【前人研究進展】miRNAs是一類廣泛存在于真核生物中的內源性、非編碼、小分子RNA，其長度為19～24 nt。miRNA于1994年在秀麗隱桿線蟲中首次被發現［2］。此后，陸續有真核生物的miRNA被鑒定出。2002年，首個植物中的miRNA在擬南芥中得到鑒定［3-4］此后，關于植物miRNAs的研究開始得到廣泛關注。隨著近年來高通量測序技術的不斷發展與廣泛應用，越來越多來自不同物種、組織的miRNA被陸續鑒定和分析，目前為止，已從80余種植物中鑒定出上萬個miRNA（miRBase數據庫，http://www.mirbase.org/）。相關研究已經證實，miRNA能在轉錄、轉錄后及翻譯水平上負向調控其靶標基因的表達，從而參與植物生長發育各方面，包括植物器官發育［5］、生理狀態轉化［6］、植物激素調控［7］、營養平衡［8］以及脅迫響應［9］等，而靶標基因中不乏大量轉錄因子，如SPL（SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like）［10］、MYB［11］、NAC［12］、ARF［13］、HD-Zip［14］和AP2［15］等，這也揭示了miRNA在基因調控網絡中的核心地位。miR156是高度保守的家族之一［16］，最初發現于擬南芥［17］，通過調控SBP/SPL基因參與植物的生長發育過程［18-19］，如種子萌發［20］、葉片發育形態建成、花期調控［21］、生殖器官發育［22］以及次生代謝物花青苷合成等［23］。Nodine和Bartel在DCL1（DICER-LIKE1）突變體中，證實miR156可在早期胚的分化階段通過調控SPL10和SPL11的表達阻止分化、促進轉錄因子的提前表達，從而實現胚的正常發育［24］。其中，早期研究更多關注種子發育過程中胚的形態建成部分，對于種子成熟方面的相關報道較為有限。Huang等［25］利用高通量測序技術分析發現，miR156家族在種子和成熟胚中的表達量最高，其中多數成員在胚發育過程中表達，且表達量隨種子成熟而呈穩定上升趨勢，是控制油菜種子發育和成熟的主要因子。隨后，Chao等［26］分析了miR156在蝴蝶蘭葉、根、花、種子等不同組織部位中的表達情況，同樣發現miR156在種子中具有較高的表達量。另有研究發現，miR156a在胡麻種子發育后期表達量顯著升高，并影響種子含油率［27］。目前，多數相關研究集中在基因鑒定和表達模式層面，關于植物種子成熟過程中miR156的調控機制尚不完整，有待進一步研究。

【本研究切入點】植物 種子成熟是一個復雜的發育過程，各環節伴隨大量基因選擇性的激活和抑制，目前該過程的調控機制著力于轉錄因子、功能蛋白、表觀遺傳等類別調控因子的研究，miRNA特別是miR156在這一生命過程中的作用及調控機制尚不清晰。【擬解決的關鍵問題】為探究miR156及其靶標基因在植物種子發育過程中尤其是成熟階段的調控功能，本研究選用miR156下調突變體MIM156及SPL過表達突變體材料，利用本實驗室建立的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）蛋白構建大豆種子貯藏蛋白基因（Conglycinin）的報告基因檢測體系，對miR156及其靶標基因是否參與種子成熟調控進行探究與分析，以期從種子貯藏蛋白積累層面為植物種子成熟調控機制提供理論依據與研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用的擬南芥突變體種子包括miR156基因家族的下調表達 突變體MIM156，SPL10過表達突變體CS66330、CS66332以及SPL11過表達 突變體CS66334、CS66335的種子均購買自ABRC種子庫。其中，下調突變體MIM156通過轉入人工合成的miR156相似序列片段獲得，該片段能與內源miR156發生競爭性抑制反應，進而間接導致內源miR156表達水平降低。SPL2ox-1和SPL2ox-2為本研究通過蘸花侵染法將SPL2基因成功轉入gus23擬南芥中純合的過表達株系。gus23由加拿大農業部倫敦研究與開發中心崔玉海研究員實驗室惠贈。WT即擬南芥（Arɑbidopsis thɑliɑnɑ）Columbia型。

將野生型擬南芥WT及各種擬南芥突變體的種子在4 ℃黑暗環境下春化3 d，播于蛭石與草炭以1∶3比例混合的濕潤基質中，隨后于22 ℃、16 h/8 h（光照/黑暗）條件下培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 擬南芥不同組織部位RNA提取與cDNA獲得 采用OminiPlant RNA Kit（Dnase I）全能型植物RNA提取試劑盒對所采集擬南芥播種后生長14 d的幼苗、蓮座葉、花和果莢等組織進行總RNA的提取，詳細步驟參考試劑盒說明書。反轉錄詳細步驟參照PrimeScript ? RT reagent Kitwith gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRaBio.，Code No.RR047A）試劑盒說明書。

1.2.2 gus23背景下突變體材料獲取 分別將突變體（MIM156、CS66330、CS66332、CS66334和CS66335）與gus23的種子進行春化、消毒并播種，待開花后選擇長勢好、花蕾茂盛的植株，除去早期幾個花蕾后，即可以擬南芥突變體為父本、gus23為母本進行雜交。雜交時間選擇在7：00—8：00最佳，此時花粉活力最強，大大增加雜交的成功率。所獲得的種子經草銨膦篩選并進行陽性植株的PCR驗證，最終篩選出純合體用于GUS染色試驗。

1.2.3 GUS染色分析 將上述雜交后代的種子播種于添加草銨膦的MS培養基中，以gus23為對照播種到MS培養皿中，春化2～3 d，放入培養室中培養并分別收集14 d的幼苗，參照Tang等［28］方法染色，具體操作如下：將去根的幼苗放入配好的X-Glucsolution染色液中，真空抽氣10～15 min后置于37 ℃條件下染色16～20 h，隨后利用75%的乙醇37 ℃脫色1 d。最后，利用體式顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 基因表達分析 分別在TAIR網站（www.arabidopsis.org）和miRBase數據庫中獲取LEC1、ABI3、FUS3以及miR156ɑ-j的序列，利用PrimerSelect和EditSeq軟件設計熒光定量引物（表1），并用NCBI Primer Blast進行引物的特異性比對。以擬南芥不同組織的cDNA為模板，采用SYBR Premix Ex Taq（Tli Rnase H Plus）（TaKaRaBio.，Code No.RR420A）進行實時熒光定量（qRT-PCR）測定不同基因的相對表達量，應用2-ΔΔCt方法進行分析。每個樣品進行3次生物學重復，3次技術重復。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences information

1.2.5 AtmiR156靶標基因的預測與分析 使用psRNA Target程序（http://plantgrn.noble.org/psRNA Target/）對TAIR數據庫中擬南芥的轉錄本進行miRNA靶標預測。psRNA Target參數設置為默認值。從TAIR網站中獲取SPL基因家族成員在野生型擬南芥不同發育時期的胚組織中的表達水平相關信息及基因序列信息，分別運用GraphPad Prism 6和MEGA5.02軟件對SPL基因家族成員進行表達水平與進化樹分析。

2 結果與分析

2.1 miR156可能參與種子成熟調控過程

為在種子貯藏蛋白積累層面探究miR156是否參與調控種子成熟過程，以來自加拿大農業部倫敦研究與開發中心崔玉海研究員實驗室的擬南芥gus23突變體（βCG:GUS的異位表達）為母本，與miR156下調突變體MIM156進行雜交，利用獲得的雜交后代進一步GUS染色。gus23突變體gus23具有β-葡萄糖苷酸酶（GUS）蛋白構建大豆種子貯藏蛋白基因（SSPs，Seed Storage Proteins）的報告基因體系，正常情況下GUS基因只在種子中表達，而在幼苗中有一些種子成熟抑制因子存在，所以GUS不能表達。當幼苗中的種子成熟抑制因子功能缺失或正向的種子成熟調控基因異位表達后，幼苗葉片便會具有GUS表型。如圖1A所示，以14 d苗齡的擬南芥gus23突變體為對照，經X-Glucsolution染色后，所有MIM156-gus23株系中，幼苗真葉呈現出GUS表型，說明種子貯藏蛋白基因在此葉片中得到了異位表達，而調控該基因表達的極有可能就是miR156。由此可推測，miR156負向調控種子貯藏蛋白基因的表達。

根據前人報道，LEC1、ABI3和FUS3是調控種子成熟的關鍵因子，在種子成熟過程中起至關重要的作用。為進一步驗證miR156對種子成熟過程的調控，本研究選取開花后7 d的擬南芥果莢材料，采用（qRT-PCR）技術對基因LEC1、ABI3和FUS3進行表達量的測定，此時期果莢內的種子中各種貯藏物質開始合成。結果表明，以野生型擬南芥WT為對照，MIM156下調表達突變體中LEC1、ABI3和FUS3的表達水平均有不同程度升高，且與WT存在極顯著差異（圖1B），說明miR156確實可以調控種子成熟過程。

圖1 MIM156-gus23的GUS表型分析及種子成熟關鍵調控基因的表達分析Fig.1 Analysis of GUS phenotype in MIM156-gus23 and expression of key genes during seed maturation

2.2 影響種子發育的miR156家族成員的鑒定

擬南芥miR156基因家族共有10個成員，分別為miR156ɑ～j，為確定是哪個成員對擬南芥種子發育產生影響、探明這些miR156在不同組中發揮的作用，本研究收集野生型擬南芥4個組織材料，分別為播種后14 d的幼苗、果莢、花和蓮座葉，并采用實時熒光定量技術對不同miR156家族成員進行組織表達特異性分析，結果見圖2。以14 d幼苗的表達量為參照，miR156ɑ、miR156d、miR156e和miR156j在果莢中的表達量最高，最低為幼苗表達量的20倍，最高可達7 000倍；miR156b、miR156h、miR156i在花中表達量最高，分別約為幼苗表達量的2.5、301.1和25.9倍，而miR156c則是在幼苗中的表達量最高；此外，沒有檢測到miR156f和miR156g。上述結果表明，miR156家族中大部分成員在擬南芥的果莢和花中有較高表達，特別是果莢中，miR156可能調控擬南芥種子的發育過程，此外miR156c在幼苗期有較高表達，說明其可能抑制與種子發育相關基因的表達。

圖2 擬南芥miR156基因家族在不同組織部位中的相對表達量分析Fig.2 Relative expression analysis of miR156 gene family in different tissues of Arabidopsis

2.3 miR156靶標基因的生物信息學分析

為進一步研究miR156家族的生物學功能，本試驗采用psRNA Target程序對TAIR數據庫中擬南芥的轉錄本進行miR156靶標基因的預測，共鑒定到10個SPL基因（圖3A），分別為SPL2、SPL3、SPL4、SPL5、SPL9、SPL10、SPL11、SPL13（A和B）和SPL15。從圖3A可以看出，miR156與上述SPL基因的序列能夠較為完美的匹配，僅個別堿基存在錯配現象，非常符合植物中miRNA與其靶標基因的序列匹配原則。

圖3 擬南芥miR156靶基因的預測、表達模式和系統發育分析Fig.3 Analysis of miR156 target genes on prediction,expression patterns and phylogenetics in Arabidopsis

利用TAIR網站查詢上述10個SPL基因在野生型擬南芥不同胚胎發育時期的表達量水平，分析結果見圖3B，自胚的八分體時期起發育至完全成熟綠胚的8個階段中，大部分SPL基因能夠展現不同程度的特異性表達，其中，SPL2、SPL10和SPL11的表達量較高，尤其是SPL2和SPL10。在八分體時期，SPL10的表達水平最高、達4.36，為同一發育時期SPL13A表達量的62倍，其次是SPL2、表達量為3.97（圖3B）。在球型胚、早期心型胚、晚期心型胚和早期魚雷型胚時期，SPL2的表達量均最高，隨后的胚發育過程中，其表達量逐漸降低。在胚發育整個過程中，SPL3、SPL4、SPL5、SPL9和SPL15的表達量極低甚至在前期SPL4根本不表達。綜上，miR156可能通過靶標SPL2、SPL10和SPL11調控種子的發育過程。

為研究miR156靶標基因間的進化關系，本研究進行了10個SPL基因的系統進化樹分析，結果表明，與表達模式相似，SPL3/4/5、SPL2/10/11以及SPL9/15分別被劃分到三組，如圖3C，在胚發育時期具有較高表達量的SPL2、SPL10和SPL11的親緣關系最近，在進化上最為相似，說明它們可能發揮相同的生物調控作用。

2.4 miR156介導SPL2、SPL10和SPL11調控種子成熟過程

鑒于SPL2、SPL10和SPL11在種子胚發育過程中具有較高的表達量，且親源關系很近，我們將這3個SPL基因作為miR156靶標基因重點探究其對植物種子發育的影響。本研究對SPL2進行克隆并利用農桿菌介導的遺傳轉化法創制了gus23背景下的SPL2ox過表達突變體材料，從中挑選2個株系進行GUS染色分析，經染色后發現SPL2-ox-1和SPL2-ox-2的子葉呈藍色（圖4）。將CS66330、CS66332、CS66334和CS66335與gus23的雜交后代分別進行染色，結果顯示，所有雜交后代均能顯現出GUS表型，但組織部位略有差異，其中，CS66330和CS66335在新發葉上有藍色GUS表型，CS66332的GUS表型集中于真葉上，CS66334則在子葉和新發葉上均表現異位的GUS活性（圖4）。種子貯藏蛋白基因在幼苗中得到表達，即SPL2、SPL10和SPL11基因的過表達影響種子貯藏蛋白基因的表達。

圖4 擬南芥AtSPL2ox、AtSPL10ox-gus23和AtSPL11ox-gus23突變體中GUS表型分析Fig.4 GUS phenotypic analysis of AtSPL2ox,AtSPL10oxgus23 and AtSPL11ox-gus23 mutants of Arabidopsis

SPL2、SPL10和SPL11作為miR156的靶標基因，受miR156的切割而與miR156呈負調控關系。miR156下調表達突變體MIM156以及靶標基因SPL2、SPL10和SPL11的GUS染色結果顯示，miR156的下調表達及上述SPLs的過表達均可影響種子貯藏蛋白基因的表達，由此形成了一條miR156調控種子成熟的調控途徑，即擬南芥miR156通過調控SPL2、SPL10和SPL11影響種子貯藏蛋白的表達從而影響種子成熟過程。

3 討論

種子是植物生長發育的基礎，也是重要的農業資源，目前我國種業發展處于瓶頸期，挖掘種子發育和成熟過程中的關鍵基因及其調控機制具有重要意義。大量研究報道表明，miR156作為保守的miRNA家族，在植物種子的胚形態建成、休眠和萌發等生物過程中發揮了重要作用，而其在植物種子成熟過程中的調控機制未見報道，為此，本研究選用擬南芥miR156下調突變體MIM156為父本與種子貯藏蛋白基因啟動子驅動GUS報告基因的檢測體系（gus23）進行雜交，以其雜交后代14 d幼苗為試驗材料進行GUS表型分析。如miR156參與種子成熟的正向調控，則在gus23檢測體系中過表達時，可能促使GUS和SSPs在幼苗中異位表達；如果參與種子成熟的負向調控，則在gus23檢測體系中功能缺失時會表現出相似結果。本研究結果中，MIM156是miR156的下調表達突變體，且在葉片中表現出藍色GUS活性，證明了miR156的表達量降低能夠促進SSPs基因的異位表達，從而負向參與種子的成熟過程。已知調控擬南芥種子發育的3個重要因子為LEC1、ABI3和FUS3，其在種子發育的許多階段起重要作用。關于LEC1、ABI3和FUS3調控擬南芥種子發育已有相關報道詳細闡述其可能的調控網絡［29-30］，然而，對于該調控網絡的激活因子尚不明確。分析qRT-PCR結果發現，此3個基因在果莢中表達量顯著上調，這為miR156作為LEC1、ABI3和FUS3調控擬南芥種子發育的激活因子提供了有力證據。

基因家族各成員在不同組織中表達量差異的測定，常用來分析基因家族在某一生物過程中的主效基因，近年來應用十分廣泛。最新研究通過分析鷹嘴豆各組織中miR156各成員表達量差異，進而推斷miR156基因家族的表達模式的相關論述［31］。本研究通過對擬南芥播種后14 d的幼苗、果莢、花和蓮座葉中miR156家族個成員的表達量分析，發現miR156ɑ、miR156d、miR156e和miR156j在果莢中的表達量最高，其中最高的miR156e，其表達量為在幼苗中的7 000倍，充分證明miR156e在擬南芥種子發育過程中起主要調控作用。同時發現miR156c在幼苗中的表達量最高，表明其可能對種子發育起抑制作用。由此推斷miR156家族在擬南芥種子發育過程中可能具有雙向調控的復雜系統。

miR156的靶標為SPL基因家族已被公認，但在調控種子萌發過程中，miR156是否同樣通過調控SPL基因家族發揮作用，目前還未見相關報道。本研究利用psRNATarget程序進行靶標預測，篩選出10個SPL靶基因，再通過TAIR網站上獲取擬南芥種子發育各個階段的表達量進行分析，研究發現果莢中表達量較高的3個基因分別是SPL2、SPL10和SPL11。進而通過對SPL基因家族系統發育進化樹的分析，結果顯示SPL2、SPL10和SPL11聚類在同一組中。相似地，在前人研究中，同樣證明了SPL10和SPL11的氨基酸相似性高達78%［32］，且在對SPL2、SPL10和SPL11的研究中，發現三者N-末端有3個保守結構域，一個是轉錄激活結構域：AHA-like motif［33］，另兩個分別是絲氨酸富集結構域和功能未知RTYF結構域，三者都是保守蛋白質結構域，說明這些蛋白在植物生長發育過程中具有重要作用［34］，而這3個SPLs基因的功能極有可能存在較高相似性。綜上，可推測miR156可能是通過調控SPL2、SPL10和SPL11的表達，進而調控種子發育和成熟過程。

為驗證SPLs基因對種子成熟過程中的作用，本研究采用gus23檢測體系進一步檢測，結果顯示CS66330和CS66335在新發葉上有藍色GUS表型，CS66332在真葉上出現GUS表型，CS66334則在子葉和新發葉上均表現出異位的GUS活性，研究結果充分證明SPL2、SPL10、SPL11對種子貯藏蛋白起正向調控作用，鑒于miR156負向調控種子成熟過程及靶標SPL基因家族，可以推測該調控網絡為miR156通過調控SPL2、SPL10、SPL11基因的表達，進而作用于LEC1、ABI3和FUS3調控網絡中，再由該調控網絡進一步控制種子貯藏蛋白基因的表達，從而影響種子的發育與成熟。

本文通過對miR156與其靶基因SPL2、SPL10、SPL11的相關研究，揭示了由miR156調控擬南芥種子發育和成熟過程中可能的調控網絡。但是對于SPL2、SPL10、SPL11基因如何將功能作用于LEC1、ABI3和FUS3調控網絡，目前的研究尚不能解決此問題，還需要進一步試驗，將這一過程的調控機制闡明和完善。

4 結論

本研究利用前期研究建立的報告基因篩選體系，對miR156下調突變體進行了GUS表型分析，表明14 dMIM156-gus23的幼苗中真葉均存在GUS活性，說明miR156基因的下調表達激活了SSPs基因的異位表達，且與種子成熟過程呈負向調控關系。為進一步驗證這一結果，本研究對種子成熟過程中的關鍵調控基因LEC1、ABI3和FUS3在MIM156中進行表達分析，結果顯示miR156的下調表達影響了這些基因在種苗中的表達情況，且與野生型擬南芥相比，LEC1、ABI3和FUS3的表達豐度顯著升高，同樣證實了miR156參與調控種子成熟過程。進一步通過生物信息學的分析及GUS表型分析，結果表明miR156的靶標基因SPL2、SPL10和SPL11正向調控種子貯藏蛋白基因的異位表達。綜上所述，本研究推測miR156極有可能作為重要調控因子作用于其靶標基因SPL2、SPL10和SPL11通過影響種子貯藏蛋白基因SSPs的表達從而對種子成熟過程進行調控。