攜帶FAT1-FAT2基因打靶載體構(gòu)建及其在豬腎細胞的表達與功能鑒定

林 純，湯 飛，李紫聰

（1.廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院護理與健康學(xué)院，廣東 廣州 510663；2.中山大學(xué)華南生物安全四級實驗室（籌），廣東 廣州 510275；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

【研究意義】ω-3多不飽和脂肪酸（PUFAs）是一類具有廣泛生物活性的物質(zhì)，對于防治人類心血管疾病、癌癥、糖尿病等具有積極作用，在臨床上已被證明具有較好的治療效果［1-3］。由于豬體內(nèi)缺乏合成兩種主要PUFAs（α-亞麻酸和亞油酸）所必需的ω-3多不飽和脂肪酸脫氫酶基因和Δ-12脂肪酸去飽和酶基因［4-5］，導(dǎo)致整個PUFAs的合成途徑受到極大限制。通過基因工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)來改變豬體內(nèi)自身合成多不飽和脂肪酸的途徑［6］，有望改變和提高豬肉中多不飽和脂肪酸的種類及含量，則人類在食用豬肉的同時還能補充必需的多不飽和脂肪酸，對人類的營養(yǎng)和健康具有積極意義，而且還可以預(yù)防心血管、關(guān)節(jié)炎等疾病發(fā)生［7］。

【前人研究進展】FAT1基因來源于秀麗隱桿線蟲，翻譯產(chǎn)物是ω-3多不飽和脂肪酸脫氫酶，該基因是合成ω-3 PUFAs的關(guān)鍵［8］。2006年Lai等在美國報道了首例轉(zhuǎn)線蟲FAT1基因的克隆豬誕生［9-10］；研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)FAT1基因豬的總ω-3 PUFAs含量比對照高了3倍多，ω-6 PUFAs含量下降了23%，并且ω-6/ω-3比例相對于對照從8.52下降到1.69；肌肉、肝臟、腎臟等主要組織中的ω-3 PUFAs含量均有所提高，揭示了FAT1轉(zhuǎn)基因豬能產(chǎn)生富含ω-3 PUFAs的豬肉，可大大提高豬肉的風(fēng)味及營養(yǎng)保健價值［7］。FAT2基因同樣來源于線蟲，是編碼Δ-12脂肪酸去飽和酶的關(guān)鍵基因，是合成ω-6 PUFAs的關(guān)鍵。2008年中國農(nóng)業(yè)大學(xué)孔平等［11］報道成功克隆了FAT2基因，并利用哺乳動物的密碼子偏好性進行優(yōu)化，構(gòu)建真核表達載體，通過細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選獲得陽性細胞群；經(jīng)過在細胞水平上的分子生物學(xué)測定分析表明，F(xiàn)AT2基因穩(wěn)定整合到CHO細胞基因組并表達，使哺乳動物細胞中的亞油酸含量顯著提高［12］。目前，去飽和酶基因的克隆主要以真菌、酵母、藻類、植物、昆蟲等為資源，其中可從藻類中克隆Δ-12、Δ-9、Δ-6、ω-3基因；從擬南芥、菠菜中克隆FAD2、FAD3基因［13］；從大豆中克隆Gm FAD3基因［14］。這些基因很多已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因試驗，以此來改良作物的油脂組成，但應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物特別是轉(zhuǎn)基因豬上的研究相對比較少。

【本研究切入點】關(guān)于ω-3多不飽和脂肪酸脫氫酶和Δ-12脂肪酸去飽和酶，前人大多數(shù)克隆單個基因進行表達，且只致力于重建ω-6PUFAs轉(zhuǎn)變成ω-3 PUFAs的通路［15-17］。哺乳動物體內(nèi)缺乏Δ-12脂肪酸去飽和酶，因此ω-6PUFAs含量稀少。本研究擬克隆編碼FAT1和FAT2基因，構(gòu)建油酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?6PUFAs以及ω-6PUFAs轉(zhuǎn)變成ω-3 PUFAs的兩個通路，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將FAT1、FAT2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)進行表達以達到更好效果?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆獲得FAT1和FAT2基因，經(jīng)密碼子優(yōu)化后構(gòu)建攜帶FAT1-FAT2雙基因的打靶載體［18］，載體含以rRNA基因間內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列為靶位點序列的DS1、DS2，NEO與EGFP融合的正篩選系統(tǒng)［19-20］，TK基因的負篩選系統(tǒng)，以及Cre-loxp刪除系統(tǒng)。將構(gòu)建好的打靶載體轉(zhuǎn)染豬腎細胞PK15，驗證目的基因在細胞水平的表達及檢測細胞中脂肪酸的相對含量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

E.coliDH5a感受態(tài)細胞（TaKaRa）購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司；載體pOSDupDel購自華燦生物科技有限公司；質(zhì)粒PF1、PUC57-2AFAT2、PCMMPD-DS1/2、PN1由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院李紫聰教授課題組構(gòu)建并保存。豬腎細胞PK15采自廣東溫氏食品集團華農(nóng)溫氏股份有限公司水臺原種豬場。

主要試劑：TaKaRa LA Taq with GC buffer、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、Ligation Kit Ver.2.0、In-Fusion? Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）均購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司，Taq Mix Kit 購自廣州東盛生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶SspⅠ、DrɑⅢ、AscⅠ、PɑsⅠ、PmeⅠ、NruⅠ等購自廣州昂科生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM LTX with PLUSTM Reagent（Invitrogen）、G418sulfate（Gibco）、DMEM（Gibco）、FBS（Gibco）、0.25%胰酶（Gibco）、DPBS（Gibco）等均購自廣州佰默生物科技有限公司。

主要儀器設(shè)備：凝膠成像系統(tǒng)（廣州三元科技有限公司）、LongGene PCR儀（M966Y,廣州深華科技有限公司）；倒置顯微鏡（TE300、TE2000U，日本Nikon）；正置熒光顯微鏡（E800，日本Nikon）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（TRACE GC-2000 GC-MSTM，美國Thermo Finnigan）。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因FAT1-2A-FAT2的獲取 為了構(gòu)建脂肪酸去飽和酶雙基因FAT1、FAT2聯(lián)合表達載體，設(shè)計一段2A連接肽，先將2A與FAT2進行基因融合，再通過重疊延伸PCR方法將FAT1基因與已融合2A片段的FAT2基因連接起來，在重疊基因兩端加上酶切位點PɑsⅠ和PmeⅠ，將雙基因同時連接到打靶載體上。

（1）2A連接肽與FAT2基因的克隆：FAT2基因來源于秀麗隱桿線蟲，該基因在NCBI上的登錄號為NM-070159，編碼區(qū)全長1 131 bp，編碼含376個氨基酸的蛋白。為使該基因在豬體上高效表達，對所獲取的序列根據(jù)豬的密碼子偏好性進行改造合成。以質(zhì)粒PUC57-2A-FAT2為模板，設(shè)計引物2A-FAT2-F、2A-FAT2-R（表1）擴增得到2A-FAT2片段。對PCR產(chǎn)物純化回收，待用。

（2）FAT1基因的克隆：以質(zhì)粒PF1為模板，設(shè)計與2A-FAT2片段重疊20 bp左右的PCR引物FAT1-F、FAT1-R（表1）擴增得到FAT1片段。對PCR產(chǎn)物純化回收，待用。

（3）FAT1與FAT2的重疊延 伸PCR：以FAT1基因與2A-FAT2基因互為共同模板，按照圖1重疊PCR設(shè)計原理進行擴增。經(jīng)普通PCR程序進行擴增后純化回收，待用。

圖1 FAT1-FAT2重疊延伸PCR引物設(shè)計原理Fig.1 Design principle for PCR primer of FAT1-FAT2 overlapping and extended

1.2.2 質(zhì)粒P-D1-FAT1FAT2-D2的構(gòu)建 設(shè)計與PF1載體酶切位點PɑsⅠ和PmeⅠ兩端重疊15 bp的引物F、R（表1），以純化回收的FAT1-2AFAT2基因為模板，進行PCR擴增FAT1-2A-FAT2基因。配制酶切體系，利用PɑsⅠ和PmeⅠ對載體PF1進行雙酶切，再把重疊基因FAT1-2AFAT2與打靶載體進行連接，構(gòu)建質(zhì)粒P-D1-FAT1FAT2-D2。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行菌液PCR，將驗證正確的菌液送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序，驗證插入目的基因的正確性。將測序正確的菌液擴繁后進行質(zhì)粒抽提，酶切鑒定后保種，待用。

表1 PCR引物信息Table 1 Information of PCR primers

1.2.3 重組質(zhì)粒PF1F2的構(gòu)建 本研究的打靶載體屬于置換型，載體上的同源重組引導(dǎo)序列與基因組正常方向一致，通過雙交換使外源DNA替換相對應(yīng)的基因組內(nèi)同源序列，由此將線性化的載體置換到基因組內(nèi)。為了使打靶載體發(fā)揮更好的作用及便于后期對中靶細胞進行檢測，一般打靶載體使用長短臂［2-3］。將已構(gòu)建好的質(zhì)粒P-D1-FAT1FAT2-D2中長約1.1 kb的HRDS1臂置換為長為2.0 kb的DS1（L）。為方便后期在Cre-loxp系統(tǒng)介導(dǎo)下刪除抗性基因Amp，在DS1（L）左側(cè)添加1個loxp位點。載體中只有NEO正篩選選擇系統(tǒng)，為了富集同源重組的克隆，提高定點整合的效率，添加負篩選基因TK，只有通過正負系統(tǒng)雙重選擇才能最大程度密集定點整合細胞。重組質(zhì)粒PF1F2的構(gòu)建路線如圖2所示。

圖2 重組質(zhì)粒PF1F2的構(gòu)建路線Fig.2 Construction route of recombinant plasmid PF1F2

（1）DS1（L）基因擴增：以質(zhì)粒PCMMPDGFP-NEO-DS1（L）為模板，設(shè)計引物L(fēng)oxp-DS1（L）-F、Loxp-DS1（L）-F（表1）擴增DS1（L）基因，并在上、下游引物兩端加入限制性內(nèi)切酶SspⅠ，PCR擴增體系及程序同常規(guī)。PCR產(chǎn)物檢測正確后純化回收。

（2）TK基因擴增：以載體pOSDupDel為模板，設(shè)計引物TK-F、TK-R（表1）擴增TK基因，并在上、下游引物兩端加入限制性內(nèi)切酶DrɑⅢ，PCR擴增體系及程序同常規(guī)。PCR產(chǎn)物檢測正確后純化回收。

（3）DS1（L）、TK基因與載 體P-D1-FAT1FAT2-D2連接：參考構(gòu)建上述質(zhì)粒的方法，通過設(shè)計DrɑⅢ、SspⅠ酶切位點，回收純化DS1（L）基因、TK基因的PCR產(chǎn)物，與P-D1-FAT1FAT2-D2進行連接、轉(zhuǎn)化。挑取轉(zhuǎn)化后的白色單菌落進行培養(yǎng)，以菌液為模板，進行菌液PCR檢測，測序鑒定等步驟，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒PF1F2。抽提質(zhì)粒，酶切鑒定后保種，待轉(zhuǎn)染細胞。為方便對TK基因進行PCR鑒定，設(shè)計引物TK（825）-F、TK（825）-R,（表1），擴增部分TK基因（長度825 bp）。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染 對液氮中取出的PK15細胞系復(fù)蘇，細胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的高糖DMEM。介導(dǎo)轉(zhuǎn)染前將細胞傳至六孔板中，待細胞長至50%～80%時，將經(jīng)過去內(nèi)毒素提取的對照質(zhì)粒PN1、PF1、PF1F2分別利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染PK15細胞，轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。

1.2.5RT-PCR檢測基因表達 分別收集質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細胞提取RNA，進行RT-PCR檢測。FAT1-FAT2雙基因PCR檢測引物序列為F：5'GGAGAAGGAGGCCCCCAGGGACGT3'，R：5'CTGATCAGCGGGTTTAAACAAAG3'；設(shè)計跨過內(nèi)含子的β-ɑctin引物，作為陽性對照，引物序列為β-ɑctin-F：5'ACCCCAAAGCCAACCGTGAG 3'，β-ɑctin-R：5'AAGCGCTCGTTGCCGATGG 3'。

1.2.6 脂肪酸分析 分別收集質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細胞，轉(zhuǎn)移到離心管中，用DPBS緩沖液洗滌細胞后離心，吸除多余水分，加入1 mL 2.5% H2SO4甲醇溶液進行甲酯化處理，充分裂解細胞，80 ℃加熱90 min；待冷卻至室溫，加入1.5 mL 0.9%NaCl溶液和1 mL正乙烷，震動、低速離心（2 000～3 000 r/min）；離心后取含有甲酯的上層溶液用于GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用分析檢測。

GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用分析條件：色譜柱DB-5，30 m×0.25 mm；恒流進樣，進樣體積1 μL；進樣口溫度220 ℃；升溫程序為100 ℃ 5 min（10 ℃/min）→200 ℃ 5min（5 ℃/min）→220 ℃10 min；載氣He，流速1.0 mL/min；EI+離子源，質(zhì)譜轟擊電子能量為70 eV、350V；質(zhì)量掃描范圍35～325 amu。譜庫檢索：MassLynx和NIST。環(huán)境條件：室溫20 ℃，相對濕度35%。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因FAT1-2A-FAT2的獲取

通過PCR分別擴增FAT1、2A-FAT2基因，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，可見到特異性擴增條帶，產(chǎn)物長度分別為1 238、1 218 bp（圖3），大小與預(yù)期相符。以FAT1基因與2A-FAT2基因互為共同模板，進行FAT1與FAT2的重疊延伸PCR，重疊延伸PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，得到2 426 bp條帶（圖3），與預(yù)期的重疊片段相符，證明成功延伸出重疊片段。

圖3 FAT1、2A-FAT2、FAT1-2A-FAT2基因擴增結(jié)果Fig.3 Amplification results of FAT1,2A-FAT2 and FAT1-2A-FAT2 genes

2.2 質(zhì)粒P-D1-FAT1FAT2-D2的構(gòu)建

利用與載體PF1酶切位點PɑsⅠ和PmeⅠ兩端重疊15 bp的引物，以純化回收的FAT1-2AFAT2基因為模板，擴增重疊基因并純化回收后，利用限制性酶切位點PɑsⅠ和PmeⅠ對打靶載體PF1進行雙酶切，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成P-D1-FAT1FAT2-D2質(zhì)粒。

質(zhì)粒P-D1-FAT1-FAT2-D2經(jīng)PCR鑒定顯示，擴增得到大小為2 439 bp的片段，與預(yù)期相符（圖4）；用PmeⅠ和BstBⅠ酶切消化質(zhì)粒P-D1-FAT1-FAT2-D2，BstBⅠ為FAT1與FAT2基因中間的1個單一限制性酶切位點，酶切后質(zhì)粒產(chǎn)生與預(yù)期相符的兩條帶，一條為插入的目的序列，大小約為1 208 bp；另一條為載體序列，大小約為11 339 bp（圖5）。而測序結(jié)果比對同源性100%，證明重疊基因FAT1-2A-FAT2已經(jīng)連接到載體上，而且片段編碼區(qū)無突變。

圖4 質(zhì)粒P-D1-FAT1FAT2-D2 PCR鑒定Fig.4 PCR identification of plasmid P-D1-FAT1FAT2-D2

圖5 質(zhì)粒P-D1-FAT1FAT2-D2酶切鑒定Fig.5 Digestion identification of plasmid P-D1-FAT1FAT2-D2

2.3 重組質(zhì)粒PF1F2的構(gòu)建

通過PCR分別擴增DS1（L）、TK基因，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，可見到特異性擴增條帶。DS1（L）基因擴增產(chǎn)物長度為2 030 bp，TK基因擴增產(chǎn)物長度為1 730 bp（圖6），大小與預(yù)期結(jié)果相符。

圖6 DS1（L）、TK基因擴增結(jié)果Fig.6 Amplification results of DS1（L）and TK genes

將DS1（L）、TK基 因PCR產(chǎn)物與載 體P-D1-FAT1FAT2-D2進行連接、轉(zhuǎn)化。用DrɑⅢ酶切質(zhì)粒PF1F2，酶切后質(zhì)粒產(chǎn)生與預(yù)期相符的兩條帶，一條為插入的TK序列，大小為1 730 bp；另一條為載體片段，大小約為13 477 bp（圖7）。將上述鑒定正確的菌液送到上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果比對同源性為100%，證明DS1（L）、TK基因均已經(jīng)連接到載體上，而且片段編碼區(qū)無突變。

圖7 PF1F2質(zhì)粒酶切鑒定Fig.7 Digestion identification of PF1F2 plasmid

2.4 細胞轉(zhuǎn)染

重組質(zhì)粒PF1F2轉(zhuǎn)染PK15細胞48 h后，在熒光顯微鏡下可看到轉(zhuǎn)染陽性率約為50%的熒光表達細胞（圖8）。

圖8 質(zhì)粒PF1F2轉(zhuǎn)染48 h后的PK15細胞Fig.8 PK15 cells transfected with PF1F2 for 48 h

2.5 RT-PCR檢測基因表達

收集質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的PK15細胞，用試劑盒提取細胞總RNA，以總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，以目的基因FAT1-FAT2的特異性引物進行PCR，同時以β-ɑctin基因作為陽性對照，用于β-ɑctin基因PCR擴增的引物跨過內(nèi)含子，引物擴增β-ɑctincDNA的片段大小為434 bp，目的基因擴增的片段大小為2 439 bp。由圖9可見，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中無DNA污染，目的基因在細胞中表達，陰性對照無檢測到基因表達。

圖9 RT-PCR檢測基因表達結(jié)果Fig.9 Result of gene expression detected by RT-PCR

2.6 脂肪酸測定結(jié)果

瞬時轉(zhuǎn)染細胞48 h后收集細胞，提取總脂肪酸進行GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用分析脂肪酸含量［17］。利用GC-MS法對對照（轉(zhuǎn)染PN1空載體）和兩個試驗組（轉(zhuǎn)染PF1，轉(zhuǎn)染PF1F2質(zhì)粒）的脂肪酸含量進行比較。

由表2可知，轉(zhuǎn)染后，與對照相比，屬于ω-6 PUFAs的亞油酸（C18:2n-6）、花生四烯酸（C20:4n-6）以及總體的ω-6PUFAs含量在試驗組中均下降，特別在轉(zhuǎn)染FAT1-FAT2雙基因的試驗組中下降比例更加顯著；屬于ω-3 PUFAs的亞麻酸（C18:3n-3）、EPA（C20:5n-3）、DHA（C22:6n-3）以及總體的ω-3PUFAs含量在試驗組中呈上升趨勢，且在轉(zhuǎn)染PF1F2質(zhì)粒的試驗組中3種不飽和脂肪酸含量相比對照存在顯著差異。ω-6/ω-3的比例由對照的1.4顯著下降到試驗組的0.42～1。ω-6PUFAs與ω-3PUFAs之間此消彼長的關(guān)系正是因為FAT1、FAT2基因表達起作用的結(jié)果。當(dāng)兩個基因同時發(fā)揮作用時，生成的ω-3 PUFAs含量更多，效果更加明顯。

表2 瞬時轉(zhuǎn)染PK細胞的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of transient transfected PK15 cells（%）

3 討論

由于哺乳動物體內(nèi)缺乏ω-3多不飽和脂肪酸脫氫酶關(guān)鍵基因FAT1、Δ-12脂肪酸去飽和酶的關(guān)鍵基因FAT2，因此不能自身合成亞麻酸、亞油酸等。本研究通過構(gòu)建攜帶FAT1-FAT2雙基因的打靶載體，通過基因表達，F(xiàn)AT1基因能夠發(fā)揮其ω-3不飽和脂肪酸脫氫酶的作用，將ω-6系列不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的ω-3不飽和脂肪酸；FAT2基因也能夠發(fā)揮其Δ-12去飽和酶的作用，將動物體內(nèi)含量較多的油酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?6不飽和脂肪酸。在這兩個基因的協(xié)同作用下，最終使得ω-6 PUFAs含量降低，而ω-3 PUFAs含量提高。

本試驗中，ω-3 PUFAs含量提高的幅度相對較低，這與轉(zhuǎn)染效率不高有一定關(guān)系，而且利用細胞測定脂肪酸含量過程中，部分脂肪酸由于樣本含量小、信號弱、不靈敏而無法檢測，因此未能顯示出所有脂肪酸組分，導(dǎo)致測定結(jié)果存在一定偏差。此外，細胞培養(yǎng)液成分含有亞油酸，如胎牛血清中含有少量亞油酸，馬血清中含有大量亞油酸，一定程度上會改變細胞中的脂肪酸組成。因此為了保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，本試驗過程中使用同一批次的胎牛血清，并且嚴(yán)格按照10%的濃度添加到培養(yǎng)基中。本試驗還利用了以豬rRNA基因間的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列ITS為靶位點，使基因打靶的靶位點增加到100～300個，從而使基因定點整合效率大幅提高。后續(xù)研究可篩選獲得定點整合FAT1-FAT2基因的轉(zhuǎn)基因細胞系，通過核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)FAT1-FAT2基因克隆豬，在豬體內(nèi)重建生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的途徑，從而提高豬肉的營養(yǎng)和保健價值。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了含NEO與EGFP融合基因及TK基因的正負篩選系統(tǒng)，以及Cre-loxp刪除系統(tǒng)的FAT1-FAT2雙基因多位點打靶載體PF1F2。載體PF1F2轉(zhuǎn)染細胞后，F(xiàn)AT1、FAT2基因可以正常表達并分別發(fā)揮ω-3多不飽和脂肪酸脫氫酶和Δ-12脂肪酸去飽和酶的作用，顯著降低細胞中ω-6 PUFAs含量，提高ω-3 PUFAs含量，降低ω-6/ω-3的比例。