外周血PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1與兒童社區獲得性肺炎病原體革蘭染色類別及耐藥水平的相關性

孫宏躍，吳建華，陶占領

（1.鄭州市婦幼保健院檢驗科，河南 鄭州 450000；2.鄭州市第一人民醫院兒科一病區，河南 鄭州 450000；3.鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450000）

兒童社區獲得性肺炎（CAP）是全球范圍內造成5 歲以下兒童死亡的主要原因之一[1]。CAP的及時診斷和疾病嚴重程度的評估，以及對病原菌的及時鑒別，對于選擇合適的治療方案以及獲得良好的預后結局，尤為關鍵。大量流行病學研究數據顯示目前兒童CAP 主要病原微生物為細菌，約占50%以上，分為革蘭氏陰性（包括大腸埃希菌和鮑曼不動桿菌等）和革蘭氏陽性細菌（包括金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌等）[2]。目前依賴細菌培養及藥敏試驗明確病原菌和耐藥情況，但這往往需要較長時間，不利于兒童患者的治療。有研究證實革蘭氏陽性和陰性細菌患者體內某些炎癥因子如降鈣素原（PCT）等的表達存在顯著差異[3]。但在兒童CAP 中是否存在類似現象，以及新型炎癥標志物CD64、Pro-ADM及sTREM-1 等是否同樣存在差異，這些指標對于不同耐藥程度的患者是否具有區分能力，目前未見相關報道。據此，本研究將探討病原菌種類及耐藥水平與炎癥標志物PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 隨機選取2017年3 月-2019年4月間于鄭州市婦幼保健院兒科就診的125例CAP患兒，所有患者年齡均低于5 歲。CAP 診斷符合中華醫學會制定的“兒童CAP 管理指南（2013年修訂）”[4]。其中男71例，女54例，平均3.58±1.21 歲。所有納入患兒均排除哮喘、過敏性肺炎和過敏性支氣管炎等肺部疾病；排除其他系統感染性疾病患者；利用酶聯免疫吸附試驗檢測MP-IgM和CPIgM 以及熒光定量PCR 法測定核酸以排除支原體和衣原體感染患者；排除入院前使用過抗生素或近期使用過免疫球蛋白的患兒；排除合并自身免疫性疾病的患兒。同時選取30例健康體檢兒童，其中男19例，女11例，平均3.61±1.13 歲。研究上報醫院倫理委員會批準，所有患兒家屬均簽訂知情同意書。

1.2 痰液標本采集及處理 采集所有患兒治療前清晨時痰標本2 份至于無菌痰培養管中，立即送至檢驗科微生物室行痰涂片和藥敏培養實驗。痰涂片應挑取膿性部分作革蘭氏染色，利用鏡檢篩選合格標本，即：鱗狀上皮細胞<10 個/低倍視野，多核WBC>25 個/低倍視野，或鱗狀上皮細胞：多核WBC<1:2.5。采用全自動微生物分析儀（美國BD 公司）鑒定細菌和藥敏實驗。按照美國臨床實驗室標準委員會制定的藥敏判定原則對藥敏結果判讀，多重耐藥為單一病原菌對3 種或3 種以上抗生素同時產生耐藥。據此將病原菌分為多重耐藥組和非多重耐藥組。

1.3 血液標本采集及處理 抽取患兒治療前清晨空腹靜脈血8ml。其中2ml 至于EDTA 抗凝管中用于CD64 指數檢測，具體方法如下：取50μl 全血于流式管底部,加入抗人CD64和CD45 抗體各10μl,充分混勻，避光孵育15min，加入500μl 溶血劑，避光10min，1200rmp 5min 離心去上清,加入鞘液1ml后1200rmp 5min 離心去上清,加入500μl 鞘液后上貝克曼FC500 流式細胞儀檢測。圈取中性粒細胞和淋巴細胞，分析CD64表達強度。另3ml 于干燥管，4000rpm 10min 分離血清后用于檢測血清PCT 檢測，采用羅氏501 電化學發光儀及配套試劑檢測。余下3ml 于干燥管，4000rpm 10min 分離血清，-80℃保存，用于酶聯免疫吸附實驗測定血清Pro-ADM及sTREM-1的濃度，試劑盒均購自購自南京森貝伽生物科技有限公司，酶標儀為科華360，所有步驟嚴格按照實際說明書執行。

1.4 統計學分析 利用Graphad prism 6.0 統計軟件處理實驗數據，所有數據以（）表示。兩樣本均數比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析；兩組間相關性利用Spearman 相關分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 125例CAP患兒痰培養和藥敏結果 125例CAP患兒經過痰培養，75例培養出單一病原菌并行藥敏實驗，細菌檢出率為60.00%；其余50例為未培養出任何細菌，疑為病毒或支原體感染。感染患兒的檢出細菌中,革蘭氏陰性菌有43例（57.33%），革蘭氏陽性菌有32例（42.67%）。21 株大腸埃希菌（28.00%）、12 株鮑曼不動桿菌（16.00%）以及10 株肺炎克雷伯菌（13.33%）構成了革蘭陰性菌譜；17 株金黃色葡萄球菌（22.67%）和15 株肺炎鏈球菌（20.00%）構成了革蘭氏陽性菌譜。革蘭氏陰性菌主要對氨芐西林、頭孢曲松和頭孢他啶耐藥；革蘭式陽性菌主要對青霉素、紅霉素以及克林霉素等耐藥率較高。75 株菌共檢出31 株多重耐藥菌，占41.33%，納入多重耐藥菌組；其余44 株菌自動入組至非多重耐藥菌組。

2.2 CAP患兒和健康對照組 間PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的差異分析 CAP患兒治療前血清PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1水平均顯著高于健康對照人群，差異具有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 CAP患兒和健康對照組間PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的比較

2.3 感染革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌CAP患兒PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的差異分析 依據感染的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌將CAP患兒分為兩組，比較結果發現革蘭氏陽性菌組PCT、Pro-ADM和sTREM-1 均顯著低于革蘭氏陰性菌組,差異具有統計學意義（P<0.05）。而CD64 指數雖在數值上低于革蘭氏陰性組,無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌間PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的比較

2.4 多重耐藥組和非多重耐藥組患兒PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的差異分析 依據藥敏結果將感染菌分為多重耐藥和非多重耐藥,結果發現多重耐藥組PCT和CD64 均顯著高于非多重耐藥組，差異有統計學意義（P<0.05）,但Pro-ADM和sTRE M-1在兩組間并無顯著差異（P>0.05）。見表3。

表3 多重耐藥組和非多重耐藥組間PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的比較

3 討論

兒童CAP 已經成為5 歲以下兒童的主要死亡原因，在該人群中較為常見，目前已經位居全球兒童常見疾病譜前列[5]。流行病學調查顯示在西方國家5 歲以下兒童CAP 發病率約為3.4%左右，而在中國每年約有35 萬左右5 歲以下兒童因CAP 死亡[6]。鑒于其極大的危害性，如何提高患兒病原學的及早診斷以獲得高效的治療方案，已經成為該領域的重點研究方向。依據病原微生物類別，兒童CAP 主要有細菌、病毒以及支原體和衣原體等[7]。其中細菌感染占據主要地位，如本研究發現125例中經過痰培養分離鑒定出75例細菌感染，占比高達60%。這與師紅玲[8]和夏厚才[9]等眾多不同地區的調查結果一致，表明我國兒童CAP患兒病原體中依然以細菌性感染為主。此外，細菌譜中革蘭陰性菌檢出率顯著高于革蘭陽性菌，主要為大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌[10,11]。革蘭陰性和陽性菌檢出率與國內大部分研究報道一致，但主要的菌譜卻有所不同，如閩南地區以肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌為主，這可能是因為地域差異以及季節流行差異造成的[12,13]。分析耐藥結果顯示，多重耐藥菌檢出率高達41.33%，這與河南地區的另一研究結果一致，提示同一地域兒童CAP多重耐藥率相似[8]。

血清學研究發現CAP患兒治療前血清PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1 等的水平均高于健康兒童，提示除了經典的PCT 指標外，CD64、Pro-ADM及sTREM-1 等或可成為兒童CAP的新型感染評價指標。這與吳佳輝等[13]發現的CD64和sTR EM-1在細菌組和支原體組CAP患兒中異常增高，以及王彥鋒等[14]在嬰幼兒細菌性肺炎患者中發現的PCT和Pro-ADM 顯著上調等結果相一致。但這些研究都沒有進一步分析這些指標是否在不同革蘭染色以及不同耐藥程度細菌間的差異。而本研究的分析結果顯示革蘭氏陰性菌組具有較高水平的PCT、Pro-ADM和sTREM-1，而CD64 指數則并無差異。郝玉清等[15]在血流感染的成年患者中也發現革蘭陰性細菌感染的患者具有較高水平的PCT和sTREM-1。此外CD64 指數在革蘭陰性和陽性菌間的差異研究并不一致，存在差異或并無差異，有待于進一步研究。但目前并沒有研究評估Pro-ADM對于革蘭氏陰性菌和陽性菌的區分能力,而本研究也初步證實Pro-ADM的這種潛力。另，多重耐藥組具有較高的PCT和CD64水平，這與羅迪等[16]評價的PCT與耐藥性的研究以及一致,但關于CD64與耐藥性的關系研究先前亦未見報道。以上結果同時也表明這些炎癥指標雖都可以提示兒童CAP細菌感染，但在預測不同革蘭染色以及耐藥情況則功能有所不同。而這一結果將有助于臨床在細菌培養前提前判斷革蘭陰陽性以及耐藥程度，以便提前合理且針對性的使用抗生素，改善患者預后。

總之，本研究初步證實高水平PCT、Pro-ADM和sTREM-1與兒童CAP 革蘭氏陰性菌感染相關；而多重耐藥菌感染患者則具有較高水平的PCT和CD64 這些炎癥指標均與與兒童CAP細菌感染密切相關,可作為預測疾病發生發展的生物標志物，但同時應當在第一時間行痰培養,明確病原菌,精準選用抗菌藥物,提高早期治療效果，改善患兒預后。