右美托咪定對大鼠心肌缺血再灌注損傷程度、氧化應激及TLR4/NF-κB 信號通路的影響

王志濤，劉德君

（鄭州大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450014）

近年來，心血管疾病的發生率正逐年增加，而在心血管疾病患者在接受治療后心肌缺血再灌注（Myocardial ischemia-reperfusion，I/R）會造成心肌細胞的損傷，影響心功能，甚至加重病情，產生預后不良，嚴重影響患者的生活質量。目前I/R 造成損傷的機制還不明確，有研究報道[1]氧化應激反應可能參與了心肌損傷，心肌缺血后氧自由基清除能力降低，當血液再灌注后，短時間內大量的氧自由基，破壞細胞膜及線粒體功能。炎癥反應[2]可能是另一個參與機制，氧自由基會引起白細胞表明特殊粘附因子的過表達，促進中性粒細胞黏附、聚集、浸潤，形成微血栓，激活自身免疫系統，產生炎癥反應，造成心肌損傷。Toll 樣受體4（Toll-like receptor4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路在炎癥反應調控過程中發揮著重要作用[3]。右美托咪定（dexmedetomidine,Dex）是一類鎮靜鎮痛藥物，常用于臨床麻醉。有報道[4]Dex在多種手術使用后能夠調控機體炎癥因子表達，拮抗氧自由基過量生成，保護組織器官，而Dex在I/R 運用較少。本研究通過Dex對大鼠I/R 后的心肌損傷、氧化應激、TLR4/NF-κB 信號通路的影響，為臨床預防提供理論基礎。報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性成年健康SD 大鼠36只，體重250±20g，由我校實驗動物中心提供，經我院動物倫理委員會批準。

1.2 試劑及儀器 大鼠肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase MB isoenzyme，CK-MB)、大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ(Cardiac Troponin Ⅰ,cTn-Ⅰ)、大鼠N 端前腦鈉素（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NTproBNP）、大鼠乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司，Anti-TLR4、Anti-NF-kB p65 抗體購于艾博抗（上海）貿易有限公司，內參抗體及二抗均購于武漢博士德生物工程有限公司，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，酶標儀購于美國伯騰儀器有限公司，電泳儀及凝膠成像系統購于美國bio-rad 公司，小型實驗動物呼吸機，購于上海嘉鵬有限公司，可見分光光度計購于上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 動物分組及造模 將所有大鼠以隨機數字表法隨機分為3 組，每組12 只。實驗組大鼠通過微量注射泵靜脈泵注5μg/kgDex 預處理，損傷組和對照組泵注同等劑量0.9%氯化鈉溶液預處理，1h 后進行造模，其中對照組只穿線不結扎。建立大鼠I/R 模型[5]：將大鼠固定于實驗臺，以烏拉坦1g/kg 腹腔注射對大鼠麻醉，切開氣管連接呼吸機進行機械通氣，沿著胸骨左緣切開第3～4 肋，行胸廓切開術以暴露心臟，對大鼠左冠狀動脈前降支進行結扎，30min 后松開結扎線，血流再灌注120min。以心電圖顯示ST段下降50%以上或高聳的T段得到恢復為造模成功標準。造模成功后采集大鼠全身血，3000r/min 離心10min，取上清保存。

1.4 檢測指標

1.4.1 心肌損傷標志物檢測 采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測各組大鼠血清中CK-MB、cTn-Ⅰ、NT-proBNP、LDH 等心肌損傷標志物表達水平。上述操作嚴格按照ELISA 試劑盒說明書操作。

1.4.2 氧化應激檢測 取各組大鼠的心肌組織，超聲粉碎，1000r/min 離心取上清液，采用可見分光光度法檢測各組SOD 活性及GSH、MDA 含量。上述操作嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4.3 TLR4/NF-κB 檢測 取各組大鼠的心肌組織，采用Western blot 法檢測TLR4、NF-κB蛋白相對表達量，具體如下[6]：⑴提取蛋白。使用裂解液充分裂解心肌組織，16000×g 離心提取蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，后水浴鍋煮，100℃，5min；⑵電泳。配置13%的濃縮膠，加入電泳緩沖液，將樣本及蛋白Marker 加入凝膠孔中，80V 下電泳50min，待蛋白Marker 到達分離膠改用120V 電泳2h。⑶轉膜。取下分離膠，按照2 層海綿、2 張濾紙、分離膠、PVDF 膜、2 張濾紙、2 層海綿順序組裝濕轉系統，加入轉膜緩沖液，低溫100 V 濕轉60min；⑷封閉。取出PVDF 膜浸泡在5%的脫脂牛奶中封閉，置于搖床室溫封閉2h。⑸洗膜：參照蛋白Marker 剪下目的條帶，TBST 洗膜3 次。⑹抗體孵育。先后加入一抗和二抗進行孵育，4℃搖床過夜。⑺顯色。PCDF膜經ECL 發光液處理，暗室曝光、顯影、定影、凝膠成像儀分析。

1.5 統計學方法對本次研究所得數據均采取SPSS22.0 統計軟件展開分析。計量資料的表達形式為（），行獨立樣本t 檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 法。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組血清CK-MB、cTn-Ⅰ、NT-proBNP、LDH等心肌損傷指標比較 見表1。

表1 三組血清CK-MB、cTn-Ⅰ、NT-proBNP、LDH 等心肌損傷指標比較

2.2 三組心肌組織SOD、GSH、MDA 等氧化應激指標比較 見表2。

表2 三組心肌組織SOD、GSH、MDA 等氧化應激指標比較

2.3 三組心肌組織TLR4、NF-κB表達水平比較實驗組TLR4的表達量為0.81±0.09，損傷組TLR4的表達量為1.57±0.15，對照組的TLR4表達量為0.18±0.03，實驗組和損傷組的TLR4表達量與對照組相比，明顯較多（P<0.05），實驗組的TLR4表達量與損傷組相比，明顯較少（P<0.05）；實驗組NFκB的表達量為0.56±0.06，損傷組NF-κB的表達量為1.21±0.11，對照組的NF-κB表達量為0.25±0.05，實驗組和損傷組的NF-κB表達量與對照組相比，明顯較多（P<0.05），實驗組的NF-κB表達量與損傷組相比，明顯較少（P<0.05）。見圖1。

圖1 三組TLR4、NF-κB水平比較

3 討論

心血管疾病會引發心臟血流灌注減少，心臟供氧不足，導致心肌缺血缺氧，心肌細胞代謝異常，心功能衰弱，心臟無法正常工作，威脅患者的生命健康。治療心肌缺血的治療方法是血流再灌注，可恢復心臟供氧供血，但是據研究報道[7]缺血再灌注后患者會出現心律失常、心肌梗死面積擴大、心功能低下等更嚴重的損傷，甚至死亡，是心血管疾病臨床治療中的障礙。目前對抗I/R的主要方法有使用缺血預適應藥物、抗氧自由基藥物、抑制鈣超載類藥物、VEC 保護劑、抗氧化劑、傳統中藥等，有報道Dex 是一類新型的鎮靜鎮痛藥物與氧化應激、炎癥反應密切相關[8]。

CK-MB 一類主要存在于心肌組織中的肌酸激酶亞型，能催化肌酸和ATP 生成磷酸肌酸和ADP，CK-MB 急性心肌梗死時3～4h 開始升高，12～28h達到高峰，可高度提示心肌損傷[9]。NT-proBNP 是BNP 激素原分裂后沒有活性的N 末端片段，主要由心室肌細胞分泌，其在人體中水平較BNP 穩定，其升高主要與內毒素及炎癥因子、心肌抑制因子及循環血容量有關，可反映心肌功能障礙，是臨床檢測心肌損傷標志物之一[10]。cTn-Ⅰ是一類調節鈣介導的肌動蛋白和肌球蛋白相互反應的蛋白，主要分布在心肌中，急性心肌梗死發病后3～6 h 開始升高，14～20 h 達高峰，是心肌損傷高度特異度的診斷標志物之一[11]。LDH 一類NAD 依賴性激酶，有多種亞型，廣泛存在于腎臟、心肌、骨骼肌中，心肌梗死后6～9 h 開始上升，36～60 h 達到高峰，因此可作為急性心肌梗死后期的輔助診斷指標[12]。研究結果顯示 損傷組I/R 后，CK-MB、cTn-Ⅰ、NTproBNP、LDH水平均顯著升高，而使用Dex的實驗組CK-MB、cTn-Ⅰ、NT-proBNP、LDH水平均明顯降低，說明I/R對心肌組織造成了明顯損傷，而Dex 有助于預防心肌損傷，保護心肌組織。

心肌缺氧時可生成大量氧自由基，氧自由基能和細胞膜上的不飽和脂肪酸使膜脂質產生過氧化反應，進而導致心肌細胞的損傷，并形成脂質過氧化物，破壞細胞膜、線粒體膜、溶酶體膜完整性，使胞膜的流動性、通透性增高[13]。SOD 能通過歧化反應催化超氧化物轉化為氧氣和過氧化氫，是動物、植物、微生物體內重要的抗氧化劑，起到抗衰老、抑制心腦血管疾病、免疫系統疾病、慢性病、抗疲勞等作用，當機體存在過量氧化物時，SOD 被大量釋放和激活，消除氧化物，可作為氧化應激反應的指標之一[14]。GSH 是三肽活性物質，分布于人體各個器官組織中，是細胞內重要的還原劑，防止由活性氧物質和重金屬對重要細胞組分造成損害，能與其結合生成谷胱甘肽二硫化物，通過谷胱甘肽還原酶還原為GSH，調節維持體內氧化還原穩態，參與多種細胞增殖、分化及凋亡等生命活動的調控。當機體存在大量的氧自由基使，GSH 被大量消耗，含量降低[15]。MDA 是機體氧自由基的主要代謝產物，其含量直接反映了組織細胞的過氧化速率和強度，是氧化應激反應損傷的重要標志物[16]。本研究結果顯示，大鼠I/R 后心肌細胞中的SOD活性增強，GSH 含量降低，MDA 含量上升，而使用Dex的實驗組SOD 活性顯著降低，GSH 含量顯著升高，MDA 含量顯著降低，說明I/R 能夠造成大量氧自由基，使心肌細胞的氧化應激反應增強，而Dex 能夠緩解心肌細胞的氧化應激，保護心肌細胞避免其的受到損傷。

在I/R 過程中，缺血的心肌細胞釋放大量損傷相關分子模式（damage associated molecular pattems，DAMPs），參與免疫應答，TLR4 被激活，經過一系列的級聯反應激活NF-κB 信號，促進下游炎癥因子的釋放，引發炎癥反應，造成心肌組織損傷[17,18]。本研究結果顯示研究結果顯示損傷組I/R 后，TLR4、NF-κB水平均顯著升高，而使用Dex的實驗組TLR4、NF-κB水平均明顯降低，說明Dex 是TLR4/NF-κB通路的負調控因子，有助于緩解I/R造成的炎癥反應，降低心肌組織的損傷。

綜上所述，Dex 能夠有效的減少I/R對心肌的損傷，降低TLR4、NF-κB的表達，負調控其信號通路，緩解氧化應激反應，有助于心肌功能恢復，保護心肌。Dex的合理劑量是接下來需要研究的重點，低劑量可能達不到效果，高劑量可能會引起不良反應發生。