豬苓菌核共生營養優勢蜜環菌初步篩選

韋中強，肖 波，李 娜，韓 量，秦 靜

（重慶市藥物種植研究所/重慶市中藥良種選育與評價工程技術中心，重慶 408435）

豬苓（Polyporus umbellatus）別名野豬苓、豬屎苓、雞屎苓、猴豬屎、地烏桃，屬膽子菌亞門層菌綱非裕菌目多孔菌科多孔菌屬。豬苓為傳統常用名貴中藥材，在我國已有2 000 多年的用藥歷史，《神農本草經》將其列為中品，其“味甘，治痞瘧，解毒，蠱注不祥，利水道，久服輕身不老。”其菌核具有利水滲濕作用［1］。自古以來我國一些民間和中醫就有豬苓治療癥癜積聚和腫瘤等癥。近年來，隨著抗癌藥的熱銷及豬苓為原料的中成藥開發，市場需求急劇增長，豬苓供需矛盾日趨尖銳，野生豬苓資源遭到過度采挖，已日益枯竭［2］，已被我國列為“三級保護野生中藥材”。同時，使得豬苓的生產方式向人工種植發展，家種豬苓與野生豬苓的化學成分無明顯的差異［3］，在栽培過程中，蜜環菌是豬苓菌核生長關鍵必備的伴生菌［4-5］，因此對豬苓菌核生長發育優勢蜜環菌作了初步篩選，以期篩選出豬苓菌核親和力強的優勢蜜環菌菌株，應用于生產，為提高豬苓產業的技術水平和規模發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

供試蜜環菌菌株引自國內豬苓和天麻主產區，菌株及來源見表1；蜜環菌菌株A9，由陜西省西鄉縣食用菌研究所提供；豬苓菌株選用生長性能表現較好的Pu-1，由陜西省西鄉縣食用菌研究所提供；豬苓菌核形成伴生菌，由重慶市藥物種植研究所藥用菌研究中心提供。

表1 蜜環菌菌株及來源

1.1.2 培養基

PDA（Potato Dextrse Agar）培養基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，自來水1 000 mL，pH 自然。

麥麩培養基配方：麥麩93.00%，葡萄糖2.00%，KH2PO40.30%，MgSO4·7H2O 0.15%，瓊脂1.00%。

1.1.3 栽培樹棒

準備直徑6 cm 粗、30 cm 長的栓皮櫟樹棒，用于豬苓栽培，截取樹枝培養Gu-7（藥植1 號）蜜環菌菌株備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同來源蜜環菌菌株生長速率考察

于25 ℃條件下，將7 個蜜環菌菌株母種分別轉接到PDA 培養基斜面上培養活化；分別轉接 PDA 平板培養備用，將培養好的7 個供試菌株分別用孔徑為0.6 cm 打孔器邊緣取樣，置于新的PDA 平板培養基中心，蓋上培養皿蓋25 ℃恒溫培養，待菌絲萌動后，每隔24 h 測量1 次菌落直徑（取3 個方向的平均值），直到菌絲長滿整個平板為止，計算出蜜環菌在PDA 平板培養基上的平均生長速度。每個菌株3 次重復。

1.2.2 不同蜜環菌菌株液體發酵菌絲體生長干重

將液體PDA培養基裝入250 mL三角瓶中，常規滅菌，在滅菌后的三角瓶培養基中分別接入0.5 cm2的蜜環菌菌塊，在25 ℃條件下搖床培養。培養20 d 后，分別將菌絲取出，并用蒸餾水沖洗菌絲體數次，洗掉菌絲體上的培養液，然后置于60 ℃烘箱中烘至恒重，再稱其干重。每個試驗設置重復3 次。

1.2.3 蜜環菌發酵液對豬苓菌絲生長影響

將蜜環菌菌株Gu-7、A9 分別接種于PDA 液體培養基中，25 ℃、120 r·min-1暗培養14 d 提取發酵液，按發酵液10 mL/皿分別制PDA 平板，分別接種豬苓Pu-1 菌絲進行培養，以不含發酵液PDA 平板培養為對照。菌絲萌動后每日同一時間測量菌落直徑，每次測3 個方向取平均值，做好記錄直至滿皿。

1.2.4 豬苓菌核誘導試驗

樹棒栽培豬苓，將準備好的樹棒每隔5～8 cm 砍1個魚鱗口；準備少量并間隔3 cm 沿縱向截取0.5～1.0 cm厚表皮的樹棒。取豬苓菌種和豬苓菌核伴生菌分別接于650 mL 棕色廣口瓶中的麥麩培養基上，置于（23±2）℃條件下避光培養，培養好備用，取出已培養感染藥植1號蜜環菌菌株的細樹枝。按如下方法誘導栽培。

誘導方法1：在花盆的底部平鋪3～4 cm 厚的粗砂，上放已感染蜜環菌菌索的細樹枝（見圖1），用粗沙覆蓋，厚度8 cm；其上放樹棒，將長滿廣口瓶的豬苓菌種和豬苓菌絲形成菌核伴生菌分別取出，間隔接種于的魚鱗口內；樹棒的兩側各放置1～2 個豬苓菌核作引子。之后用粗砂覆蓋，厚度為5 cm。

誘導方法2：方法1 中改放樹棒，間隔接豬苓菌種和伴生菌于去掉表皮樹棒的縱截面上，之后蓋上其樹皮。其余相同。

誘導方法3：方法1 中改放樹棒，接豬苓菌種于樹棒兩端的截面處；接伴生菌于棒中間所砍魚鱗口內。其余相同。

誘導方法4：方法1 中放已感染蜜環菌菌索的細樹枝后，改粗砂覆蓋厚度1 cm。其余相同。

誘導方法5：方法1 中不放蜜環菌菌枝；其余相同。

誘導方法6：方法1 中不放豬苓菌核作引子；其余相同。

誘導方法7：方法1 中不接伴生菌；其余相同，本方法為對照。

對照和每1 誘導方法（處理）分別重復5 次。澆水保持濕度，（23±2）℃條件下培養。

2 結果與分析

2.1 不同來源蜜環菌菌株生長速率

菌絲體的生長，在營養供應等條件適宜的情況下沒有明顯的波動，大體上呈勻速生長。培養3 d 后開始出現菌索，平板培養的第5 d，菌落直徑約為培養皿直徑的2/3，按照此時的菌落直徑計算菌絲日平均生長速度，見表2。

表2 不同蜜環菌菌株菌絲生長速率

根據結果，不同蜜環菌菌株菌絲的日平均生長速度從大到小的順序為Gu-7 ＞Gu-5 ＞Gu-3 ＞Gu-6 ＞Gu-1 ＞Gu-2 ＞Gu-4，說明Gu-7，Gu-5，Gu-3 菌株的生長性能較為優勢。

2.2 不同蜜環菌菌株液體發酵菌絲體生長干重

經發酵培養，不同來源蜜環菌菌株菌絲體干重統計結果見表3。

表3 不同蜜環菌菌株菌絲干重

試驗結果表明：7 株蜜環菌菌株液體培養菌絲體干重以Gu-7 最高（4.76 mg/10 mL）,其次是Gu-5（4.25 mg/10 mL），最低為Gu-4（2.24 mg/10 mL），說明Gu-7、Gu-5、Gu-3 菌株的液體發酵生長性能較佳。

2.3 蜜環菌發酵液對豬苓菌絲生長的影響

不同來源蜜環菌發酵液對豬苓菌絲生長的影響觀察，觀察到兩株蜜環菌發酵液處理的豬苓菌絲生長情況均較穩定（見圖1），并且這兩種蜜環菌發酵液處理的豬苓菌絲生長情況均好于對照（CK），并測定豬苓菌絲生長速率統計結果見表4。

圖1 培養的蜜環菌樹枝菌種

表4 固體培養的豬苓菌絲平均生長速率

試驗結果表明，供試兩株蜜環菌發酵液處理的豬苓菌絲平均生長速率都高于CK，并且A9、藥植1 號發酵液對豬苓菌絲生長起到促進作用，A9 處理的豬苓菌絲平均生長速率與藥植1 號，差異不明顯，與對照相比達顯著水平。

2.4 豬苓菌核誘導試驗

樹棒栽培誘導豬苓菌核播種后120 d，試驗觀察結果見表5。從表中不同誘導方法對豬苓菌絲形成菌核影響可以看出，誘導方法1、誘導方法2、誘導方法5、誘導方法6 豬苓菌株和伴生菌均生長良好，菌核形成較快，數量較多，見圖2。誘導方法3 形成的菌核較少，誘導方法4和7 無菌核形成。豬苓生產菌核形成是關鍵，豬苓菌核后續生長需要共生蜜環菌提供營養，觀察到蜜環菌感染了豬苓菌核，菌索侵入了菌核，見圖3，為豬苓生長提供營養。

圖2 誘導形成豬苓菌核

表5 不同栽培方法對豬苓菌絲形成菌核的影響

圖3 蜜環菌侵染豬苓菌核生長情況

樹棒誘導栽培，從栽培角度綜合考慮，誘導方法6優于其他誘導方法，該方法有利于提供大量的菌核，適用于大面積生產，當豬苓菌核形成后蜜環菌侵入菌核，持續提供豬苓菌核繼續生長發育的營養。

3 結論與討論

豬苓生產中，豬苓菌核形成后，后續生長必需依靠共生蜜環菌提供營養，支撐其發育繁殖形成豬苓商品，所以優良的蜜環菌菌株對豬苓生產尤其重要。本試驗結果表明，蜜環菌Gu-7 菌株日生長速率6.130 mm·d-1和菌絲體干重4.76 mg/10 mL）是7 株供試菌株中較為突出，表現出生長性能優勢的菌株。蜜環菌對豬苓菌核是從灰苓階段起侵入的，在樹棒栽培中也觀察到蜜環菌菌索侵染灰苓，菌核前段白苓沒有菌索侵染，說明中間豬苓與蜜環菌存在一定的識別機制，這與已報道的研究類似。蜜環菌Gu-7、A9 發酵液對豬苓菌絲生長有明顯的促進作用，根據王秋穎等人的研究結果也得到了印證［6］。傳統豬苓栽培一般采用小菌核作種源，由于豬苓菌核生長緩慢、生產周期較長（一般3～5 年）、繁殖率低、投種量較大，很難提供大量豬苓小菌核用于人工栽培，苓種匱乏，是制約人工栽培豬苓產量、質量及效益的主要因素；運用大量生產的蜜環菌Gu-7 菌株，并通過本試驗7 種豬苓菌核誘導栽培模式探討，誘導方法1、誘導方法2、誘導方法5 和誘導方法6 能較快培育大量種苓，有利于豬苓大面積推廣栽培。栽培方法6 優勢明顯，在優質蜜環菌共生條件下，有利于豬苓菌核生長形成商品。但有待進一步探討蜜環菌對豬苓商品產量、質量形成的影響。