水通道4基因敲除對嗎啡誘導小鼠條件性位置偏愛及神經(jīng)發(fā)生的影響

王志媛，吳 寧，李 錦

（軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，神經(jīng)精神藥理學北京市重點實驗室，北京 100850）

水通道（aquaporin，AQP）是水轉(zhuǎn)運的特異性孔道蛋白，廣泛分布于眾多組織中，為水分子快速透過細胞膜的運輸提供主要途徑［1］。在哺乳動物體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)了13種AQP蛋白亞型（AQP0～AQP12），其中AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達最豐富的AQP亞型，在星形膠質(zhì)細胞足突中呈極化分布。直接與血管和神經(jīng)突觸發(fā)生接觸［2］。AQP4一直被認為是腦內(nèi)水和離子穩(wěn)態(tài)的關鍵調(diào)節(jié)分子。近期的研究還表明，AQP4參與了包括腦缺血、腦水腫和情感障礙性精神疾病等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程［3-5］。

阿片成癮是一種慢性復發(fā)性精神疾病［6］。阿片類物質(zhì)強大的獎賞效應是成癮啟動的前提，長期暴露于阿片類物質(zhì)誘導的皮質(zhì)、海馬和伏隔核等多個腦區(qū)神經(jīng)可塑性的改變是成癮形成的關鍵。阿片成癮本質(zhì)上是由不良適應介導的異常的學習記憶，海馬是參與學習記憶的重要部位，因此海馬神經(jīng)可塑性在阿片成癮中的作用越來越受到關注［7-8］。神經(jīng)發(fā)生是神經(jīng)可塑性的重要組成部分，由一系列生物學事件構(gòu)成，包括神經(jīng)前體細胞的增殖、遷移和分化產(chǎn)生成熟的神經(jīng)元，以及新生神經(jīng)元與周圍神經(jīng)回路的整合［9-11］。成年哺乳動物海馬齒狀回顆粒細胞層下區(qū)（subgranular zone，SGZ）是神經(jīng)元發(fā)生的重要區(qū)域之一，新生成熟的神經(jīng)元在顆粒細胞層產(chǎn)生樹突和軸突，整合到現(xiàn)有的神經(jīng)回路中，參與海馬的各種功能活動。嗎啡（morphine，Mor）和可卡因等慢性給藥可抑制海馬神經(jīng)發(fā)生［12-13］，且主要影響SGZ神經(jīng)前體細胞的增殖。此外，有文獻報道，AQP4缺失可抵抗可卡因?qū)ｑR神經(jīng)發(fā)生的抑制作用［13］，但其對成癮記憶影響的研究未見報道。

條件性位置偏愛（conditioned place preference，CPP）模型是研究藥物的獎賞效應和成癮相關記憶的經(jīng)典模型。本研究采用CPP模型研究AQP4基因敲除對Mor誘導的小鼠CPP效應形成以及海馬神經(jīng)前體細胞增殖、存活和分化的影響，探討APQ4在阿片成癮相關記憶中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物

野生型（wild type，WT）及AQP4基因敲除型（knock out，KO）CD1小鼠，雄性，3月齡，體重25～30 g，南京醫(yī)科大學神經(jīng)藥理研究室提供，由軍事科學院軍事醫(yī)學研究院實驗動物中心飼養(yǎng)繁殖，合格證號 SCXK-（軍）2007-004，飼養(yǎng)環(huán)境溫度 20～22℃，濕度40%～60%，12/12 h明暗循環(huán)，小鼠每籠5～6只，自由攝食飲水。所有實驗遵循軍事科學院軍事醫(yī)學研究院實驗動物倫理委員會的規(guī)定。

1.2 藥品、試劑和主要儀器

Mor（批號：910907），青海制藥廠；5′-溴脫氧尿嘧啶（5-bromodeoxyuridine，BrdU），德國Calbiochem公司；小鼠抗BrdU多克隆抗體（批號：MAB3510）和小鼠抗神經(jīng)元特異性核抗原（neuronspecific nuclear，NeuN）單克隆抗體（批號：MAB-377），美國Chemicon公司；大鼠抗BrdU多克隆抗體（一抗）（批號：MCA2060），英國Serotec公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG抗體（二抗）、FITC標記山羊抗大鼠IgG抗體（二抗）、TRITC標記山羊抗小鼠IgG抗體（二抗）、濃縮型3，3-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）免疫組化染色試劑盒（批號：ZLI-9031）、Triton-100、防脫磨砂載玻片和蓋玻片，均購自北京中杉金橋公司。恒溫冰凍切片機，德國萊卡公司；光學顯微鏡，日本Olympus公司；激光共聚焦顯微鏡，德國Carl Zeiss公司。

1.3 小鼠CPP行為實驗系統(tǒng)

小鼠3箱式CPP系統(tǒng)及視頻分析軟件，寧波安萊公司。左右2箱的墻壁分別為黑色和白色，內(nèi)徑均為25 cm×25 cm×30 cm，2箱底部分別安置橫欄和網(wǎng)格的鐵絲網(wǎng)各1塊。中間箱位于黑、白箱之間，灰色墻壁光滑底面，大小為10 cm×25 cm×30 cm。中間箱與黑、白2箱之間各有穿梭門1個，3箱的頂部都有1個LED燈和1個攝像頭。所有數(shù)據(jù)均通過計算機視頻跟蹤系統(tǒng)進行記錄。

1.4 小鼠CPP實驗［14］

47只小鼠隨機分為WT對照組（WT-control，WT-Con，n=12）、WT-Mor組（n=11）、AQP4基因KO-Con組（n=12）和 AQP4基因 KO-Mor組（n=12）。各組小鼠在實驗環(huán)境中飼養(yǎng)2 d后進行CPP實驗，實驗分為預適應期、條件性訓練期和表達測試期3個階段（圖1）。

預適應期（D1～D3）：移開CPP裝置各室之間的隔板，使小鼠能在各室之間自由活動，每天適應1次（15 min），D3適應的同時記錄小鼠在各箱停留時間，判斷小鼠的天然偏愛性。根據(jù)前期實驗結(jié)果，小鼠對黑箱表現(xiàn)出天然偏愛性，因此所有小鼠均在非偏愛側(cè)（白箱）伴藥。

條件性訓練期（D4～D11）：訓練時插上隔板，使小鼠限制在黑箱或白箱中45 min。每只小鼠每天上、下午各接受1次訓練，2次訓練間隔至少6 h。D4，上午各組小鼠均sc給予生理鹽水10 mL·kg-1，下午WT-Mor組和KO-Mor組sc給予Mor 10 mg·kg-1、WT-Con組和KO-Con組sc給予生理鹽水；D5，上午WT-Mor組和KO-Mor組sc給予Mor 10 mg·kg-1、WT-Con組和KO-Con組sc給予生理鹽水，下午各組均sc給予生理鹽水；每次給藥后，將小鼠放入非伴藥側(cè)（即黑箱）訓練，以此類推，連續(xù)訓練8 d。

Fig.1 Schematic representation of experimental procedures.Mice were devided into wild type-control（WT-Con），WT-morphine（WT-Mor），knockout（KO）-Con and KO-Mor groups.During the conditioning phase of conditioned place preference（CPP），mice were administered with Mor（10 mg·kg-1，sc）or saline once a day on D4-D11.For analysis of cell proliferation，mice were injected with bromodeoxyuridine（BrdU）（50 mg·kg-1，ip，once every 2 h for four times）on D13.Mice were sacrificed 24 h after last BrdU administration to detect proliferation.Mice were sacrificed on D41 to determine the survival and differentiation of newborn cells.

表達測試期（D12）：將隔板打開，使動物可在3箱內(nèi)自由穿梭，記錄15 min內(nèi)動物在伴藥（白箱）側(cè)停留的時間。

1.5 BrdU免疫組化染色檢測SGZ神經(jīng)前體細胞增殖

CPP表達測試后第2天（D13），各組小鼠ip給予BrdU 50 mg·kg-1（每2 h注射1次，共4次）標記神經(jīng)前體細胞。每組隨機取6只小鼠，在末次給予BrdU 24 h后處死，取腦組織在4%多聚甲醛中后固定24 h，在含30%蔗糖的0.1 mol·L-1PBS中脫水4 d，連續(xù)冰凍切片（厚度30 μm）。從海馬喙側(cè)向尾側(cè)收集SGZ區(qū)（約大腦前囟后1.06 mm至前囟后3.08 mm）腦片，從每6張腦片中取1張，按照文獻［13］方法進行BrdU免疫組化染色。每張切片滴加3%過氧化氫處理30 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶，而后滴加含5%牛血清白蛋白和0.3% TritonX-100的0.1 mol·L-1PBS室溫封閉1 h，將切片在小鼠抗BrdU一抗（1∶10 000）中4℃孵育過夜，0.01 mol·L-1PBS漂洗3次后，加辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體（二抗）（1∶800），DAB顯色，脫水封片。在光學顯微鏡下計數(shù)SGZ區(qū)BrdU陽性（BrdU+）細胞數(shù)以反映神經(jīng)前體細胞增殖。光學顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下（×40物鏡）對所有的位于海馬齒狀回顆粒細胞下區(qū)的BrdU+細胞進行計數(shù)，顆粒細胞層外2個細胞距離以外以及焦平面以外的BrdU+細胞不計在內(nèi)。SGZ的全部BrdU+細胞數(shù)通過計數(shù)12張腦片數(shù)值相加后乘以6而得到。

1.6 BrdU/NeuN免疫熒光雙染檢測神經(jīng)前體細胞的存活和分化［5］

每組5～6只小鼠在BrdU標記28 d后（D41）處死，腦組織處理及冰凍切片方法同1.5。用含5%牛血清白蛋白和0.3% TritonX-100的0.1 mol·L-1PBS室溫封閉1 h后，同時加入大鼠抗BrdU一抗（1∶100）和小鼠抗NeuN一抗（1∶100），4℃孵育過夜。0.01 mol·L-1PBS漂洗3次后，加入熒光標記的二抗，分別為山羊抗大鼠IgG抗體-FITC（綠色熒光，1∶1000）和山羊抗小鼠IgG抗體-TRITC（紅色熒光，1∶1000）。在激光共聚焦顯微鏡下觀察計數(shù)BrdU+，NeuN+和 BrdU+NeuN+細胞數(shù)，小鼠海馬SGZ內(nèi)少數(shù)NeuN+細胞同時呈現(xiàn)BrdU+，表明是由存活下來的神經(jīng)前體細胞分化而來的神經(jīng)元。BrdU+細胞存活率（%）=存活的BrdU+細胞數(shù)/各組增殖的BrdU+細胞平均數(shù)×100%；神經(jīng)元分化率（%）=BrdU+NeuN+細胞數(shù)/存活的BrdU+細胞數(shù)×100%。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 AQP4基因敲除對Mor誘導的小鼠CPP效應形成的影響

Mor誘導CPP實驗結(jié)果（圖2）顯示，WT-Con組與KO-Con組小鼠伴藥箱停留時間無顯著差異；WT-Mor組和KO-Mor組的伴藥箱停留時間分別顯著高于WT-Con 組和KO-Con組（P＜0.01，P＜0.05），但KO-Mor組伴藥箱停留時間顯著低于WT-Mor組（P＜0.05），提示AQP4基因敲除降低Mor誘發(fā)CPP效應的形成。

Fig.2 Effect of AQP4 knockout on acquisition of Morinduced CPP.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=11-12.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with Con group of the same genotype；#P＜0.05，compared with WT-Mor group.

2.2 AQP4基因敲除對Mor慢性處理后小鼠海馬SGZ神經(jīng)前體細胞增殖的影響

WT和KO小鼠海馬SGZ分布著一定數(shù)量BrdU+的神經(jīng)前體細胞，呈單個或簇狀分布，大多為不規(guī)則狀（圖3A）。BrdU+細胞計數(shù)（圖3B）結(jié)果顯示，WT-Mor組BrdU+細胞數(shù)顯著減少至WT-Con組的（71.7±12.4）%（P＜0.05），而WT-Con組與KO-Con組、KO-Mor組與WT-Mor組和KO-Mor組與KO-Con組間BrdU+細胞數(shù)均無顯著差異。

2.3 AQP4基因敲除對Mor慢性處理后小鼠海馬SGZ神經(jīng)前體細胞存活和分化的影響

BrdU標記28 d后，小鼠海馬SGZ內(nèi)少數(shù)NeuN+細胞也呈現(xiàn)BrdU+，表明是由存活下來的神經(jīng)前體細胞分化而來的神經(jīng)元（圖4A）。BrdU+細胞計數(shù)（圖4B）結(jié)果顯示，WT-Mor組BrdU+細胞數(shù)顯著低于WT-Con 組（P＜0.05），提示Mor連續(xù)處理8 d顯著降低小鼠SGZ神經(jīng)前體細胞的存活數(shù)量；KO-Con組與WT-Con組和KO-Mor組與KO-Con組間BrdU+細胞數(shù)無顯著差異，提示AQP4基因敲除對基礎狀態(tài)下，神經(jīng)前體細胞的存活數(shù)量無顯著影響，且能消除Mor對神經(jīng)前體細胞存活的抑制作用。BrdU+細胞存活率（即BrdU標記28 d細胞數(shù)與BrdU標記24 h細胞數(shù)的比率），WT-Mor組與WT-Con組相比和KO-Mor組與KO-Con組相比無顯著差異，且KO-Mor組的BrdU+細胞存活率〔（60.2±10.1）%〕與WT-Mor組〔（35.3±9.3）%〕相比顯著升高（P＜0.05）（圖4C）。提示AQP4基因敲除具有提高Mor處理8 d后小鼠海馬SGZ神經(jīng)前體細胞存活的作用。

Fig.3 Effect of AQP4 knockout on proliferation of neural progenitor cells in subgranular zone（SGZ）after chronic Mor treatment.See Fig.1 for the mouse treatment.A：neural pregenitor cell proliferation in SGZ by immunohistochemical staining.The arrows show BrdU immunostaining positive（BrdU+）cells.±s，n=6.＊P＜0.05，compared with WT-Con group.

新生神經(jīng)元數(shù)量（即BrdU+NeuN+細胞數(shù)），WT-Mor組顯著低于WT-Con組（P＜0.05），提示Mor連續(xù)處理8 d顯著降低新生神經(jīng)元的數(shù)量KO-Con組與WT-Con組間和KO-Mor組與KO-Con組間均無顯著差異，但KO-Mor組顯著高于WT-Mor組（P＜0.05）（圖4D），提示AQP4基因敲除對基礎狀態(tài)下新生神經(jīng)元的數(shù)量無顯著影響，但能夠消除Mor抑制新生神經(jīng)元數(shù)量的作用。另外，各組神經(jīng)元分化率無顯著性差異（圖4E），提示Mor連續(xù)處理8 d或AQP4基因敲除均不影響神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元的分化。

Fig.4 Effect of AQP4 knockout on survival and differentiation of neural pregenitor cells in SGZ after chronic Mor treatment.See Fig.1 for the mouse treatment.A：the survival and differentiation of BrdU+cells by immunofluorescent staining.The red，green and yellow arrows indicate the neuron-specific nuclear（NeuN）immunostaining positive（NeuN+），BrdU+and BrdU+NeuN+cells，respectively.Survival rate of BrdU+cells（%）=the number of surviving BrdU+cells/average number of proliferated BrdU+cells×100%.Neural differentiation rate（%）=the number of BrdU+NeuN+cells/the number of surviving BrdU+cells×100%.±s，n=5-6.＊P＜0.05，compared with Con group of the same genotype；#P＜0.05，compared with WT-Mor group.

3 討論

神經(jīng)發(fā)生對于正常腦功能具有重要意義，目前對成年海馬齒狀回SGZ神經(jīng)發(fā)生的生理學功能研究顯示，增強SGZ的神經(jīng)發(fā)生能促進依賴于海馬的學習記憶過程［15-16］。阿片成癮是一種病理性的學習記憶，已有文獻報道Mor和可卡因慢性處理能抑制SGZ神經(jīng)前體細胞的增殖［17-18］，而AQP4敲除后能抵抗可卡因?qū)ι窠?jīng)前體細胞增殖的抑制［18］，這與本文的研究結(jié)果一致。而新生的神經(jīng)前體細胞必須存活下來并遷移到適當?shù)哪X區(qū)，分化成為神經(jīng)元與周圍神經(jīng)回路產(chǎn)生突觸聯(lián)系，才具有功能。因此，本研究觀察了AQP4在神經(jīng)前體細胞增殖中的作用，重點關注了AQP4對新生的神經(jīng)前體細胞存活和分化的影響，并應用CPP模型考察AQP4通過調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生參與阿片成癮的病理性學習記憶過程的可能性。

CPP模型是研究與獎賞相關的學習和記憶的經(jīng)典范式，通過一段時間的情境因素與藥物獎賞效應的關聯(lián)性訓練，動物產(chǎn)生對這種情境因素的記憶，被稱為經(jīng)典的巴甫洛夫聯(lián)合學習［19］。Mor和可卡因等成癮性物質(zhì)誘發(fā)的強大而持久的獎賞效應及獎賞相關記憶是形成及維持成癮狀態(tài)、以及戒斷后復吸的重要原因，兩者缺一不可，共同促成CPP效應的形成。包括本課題組在內(nèi)的以往研究發(fā)現(xiàn)，AQP4基因敲除能增強Mor鎮(zhèn)痛、降低Mor的鎮(zhèn)痛耐受和軀體依賴［20］以及可卡因誘導的高活動性及多巴胺釋放［18］。本課題組最近的研究顯示，在小鼠高活動性實驗和靜脈自身給藥實驗中，AQP4基因敲除減弱阿片類物質(zhì)（Mor和海洛因）引起的精神興奮效應和強化效應（待發(fā)表）；但對獎賞相關記憶有何影響尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，AQP4基因敲除能降低Mor誘導的小鼠CPP效應的形成與表達，提示AQP4除直接參與阿片類的獎賞及強化效應外，還有可能參與獎賞相關記憶的形成，有助于從多角度理解AQP4在藥物成癮中的作用。成癮性物質(zhì)CPP效應的形成依賴于海馬介導的情境關聯(lián)性學習，有研究發(fā)現(xiàn)AQP4基因敲除降低了小鼠水迷宮任務中空間參考記憶的形成與鞏固［21］，提示海馬依賴的學習能力降低。

動物及臨床相關實驗都證明了海馬齒狀回在情境線索依賴的獎賞記憶中起重要作用［22-23］。齒狀回SGZ區(qū)是成年腦神經(jīng)發(fā)生的重要區(qū)域，其中成年后產(chǎn)生的顆粒細胞神經(jīng)元涉及海馬依賴性功能的許多方面，包括與情境相關的學習和記憶，如對相似情境線索的辨別、記憶的鞏固以及消退學習等［24-26］。研究顯示，在基于獎賞的情境線索學習相關范式（如CPP）中，在成癮記憶消退學習期間，消融成年海馬神經(jīng)發(fā)生能增強藥物獎賞記憶的長期保留能力［27-29］。本研究在Mor誘導的CPP表達測試24 h后給予BrdU標記，標記24 h的BrdU+細胞是新發(fā)生的神經(jīng)前體細胞，BrdU標記4周后的BrdU+細胞為存活下來的細胞，BrdU+/NeuN+細胞為由存活下來的神經(jīng)前體細胞分化的功能性神經(jīng)元。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AQP4基因敲除能抵抗Mor慢性處理引起的新生神經(jīng)前體細胞存活和分化的功能性神經(jīng)元數(shù)量的降低，提示AQP4可能通過參與神經(jīng)發(fā)生影響成癮性藥物獎賞相關記憶的消退學習，進而對長期覓藥行為產(chǎn)生影響。結(jié)合本研究結(jié)果及文獻報道，我們推測AQP4基因敲除減弱Mor誘導的小鼠CPP效應的形成，可能與AQP4參與多巴胺釋放進而減弱獎賞效應有關；而AQP4基因敲除對神經(jīng)發(fā)生的影響可能參與CPP長期效應，如消退學習以及成癮記憶的長期保留等。腦內(nèi)學習記憶的編碼和儲存，需要突觸在數(shù)量、結(jié)構(gòu)、功能上發(fā)揮有序的變化，這些變化統(tǒng)稱為神經(jīng)可塑性［30］。在本研究中，我們應用免疫熒光染色重點觀察了新生的神經(jīng)前體細胞分化為神經(jīng)元的數(shù)量，對于神經(jīng)元的發(fā)育指標（樹突棘的長度、分支及其復雜度）的研究能更詳細地反映分化后的神經(jīng)元功能及突觸可塑性的變化，將是后續(xù)研究的重點。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，AQP4基因敲除降低Mor誘導的小鼠CPP效應的形成，同時抵抗Mor慢性處理對海馬神經(jīng)發(fā)生的抑制，主要是通過減輕Mor對神經(jīng)前體細胞增殖、存活和分化的抑制而實現(xiàn)的。AQP4對神經(jīng)發(fā)生能力的調(diào)節(jié)可能是其影響阿片獎賞相關記憶及成癮的機制之一，但詳細機制尚需進一步研究。