響應面耦合遺傳算法優化超聲-酶輔助提取金銀花綠原酸工藝及其抗氧化活性研究

谷 紅，尹本林，袁建全，裴云逸

（1.玉溪農業職業技術學院，云南 玉溪653100；2.云南省農業科學院質量標準與檢測技術研究所，云南 昆明650205）

金銀花（Lonicera japonicaThunb.）又稱為金花、雙花和銀花，為忍冬科忍冬屬。金銀花提取物中含有黃酮類、三萜類、有機酸類、環烯醚萜類、糖類和醇類等活性成分[1]。其中綠原酸和黃酮類化合物是金銀花中最重要的活性成分。大量研究結果表明：金銀花綠原酸具有較好的抗氧化活性，同時具有較強的藥理活性，對消化系統、血液系統及生殖系統等方面的疾病具有顯著的治療效果[2-3]。金銀花中活性成分的提取是金銀花產業中最關鍵的環節，也是制約金銀花發展的瓶頸，因此尋找綠色高效的提取技術是當前研究的熱點。

超聲提取是一種新型的物理提取技術，超聲所產生的“空化效應”、“機械效應”和“熱效應”加速了植物細胞壁的破裂，降低活性成分的傳遞阻力，從而顯著提高活性成分得率[4-5]。植物細胞壁主要成分為纖維素和果膠，通過利用纖維素酶和果膠酶來水解植物細胞壁，可以顯著降低活性成分由內向外的傳質阻力，促進活性成分的提取分離[6]。因此，利用超聲-酶輔助提取金銀花綠原酸是一種新穎的提取技術，目前在金銀花綠原酸提取中還未見報道。此外，影響金銀花綠原酸提取率的因素有溶劑性質、萃取溫度、萃取時間、固液比和超聲功率等。因此，優化金銀花綠原酸的提取條件是提高金銀花綠原酸提取率的關鍵。響應面法（Response surface methodology,RSM）是一種數學統計方法，常被應用于提取工藝優化，但RSM對試驗點的選擇有很高的要求，試驗點選取不當，很難得到理想的優化結果[7]。遺傳算法（Genetic algorithms,GA）具有全局尋優的特點，能取得較好的預測和優化效果。將RSM與GA相結合，既能避免RSM的缺陷，又能充分發揮GA在全局優化中的優勢。因此，本試驗采用該組合方法來對金銀花綠原酸的提取條件進行優化，同時探究該提取條件下獲得的金銀花綠原酸提取物的抗氧化活性。本文通過超聲-酶輔助提取法對金銀花綠原酸進行提取，進而探究超聲功率、提取時間、提取溫度、果膠酶添加量和乙醇體積分數對金銀花綠原酸提取率的影響，并通過RSM耦合GA來優化其提取工藝，最后探究金銀花綠原酸提取物的體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

金銀花，采于河南封丘；綠原酸標準品（≥98%），張家界久瑞生物科技有限公司；果膠酶（6.0×105U/g），合肥博美生物科技有限責任公司；DPPH，酷爾化學科技（北京）有限公司；過硫酸鉀和乙酸鈉，上海金錦樂實業有限公司；水楊酸和雙氧水，上海澄紹生物科技有限公司；乙醇（分析純），常州市啟迪化工有限公司。

1.1.2 儀器與設備

HJ911-8P超聲波提取儀，上海達洛科學儀器有限公司；LGJ-20G冷凍干燥機，四環福瑞科儀科技發展（北京）有限公司；RX-Z005旋轉蒸發儀，建湖瑞祥玻璃制品有限公司；UV759紫外可見分光光度計，青島聚創環保集團有限公司；JIDI-20D臺式高速離心機，廣州吉迪儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

金銀花經除雜，冷凍干燥處理，并利用植物粉碎機將其粉粹，過40目篩，制得金銀花粉末，密封避光保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 超聲-酶輔助提取綠原酸

稱取5.0 g金銀花粉末置于具塞三角瓶中，按照1∶30（g/mL）的料液比加入不同體積分數的乙醇溶液，用玻璃棒攪拌使其充分混合，然后加入不同添加量的果膠酶，將其置于超聲波提取儀中，通過儀器控制面板，設置超聲時間和超聲溫度，待提取結束后，將提取物置于離心機中以7 000 r/min離心15 min，真空抽濾獲得濾液，殘渣重復上述操作，合并濾液。將部分濾液用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，用于測定不同提取條件下綠原酸的提取率。此外，取另一部分濾液置于40℃旋轉蒸發儀減壓濃縮，真空冷凍干燥，制得綠原酸提取物。

1.2.3 綠原酸提取率測定

1.2.3.1 金銀花中綠原酸標準曲線的制作

準確稱取綠原酸標準品0.005 g，加入少量體積分數為70%乙醇溶液，使標準品充分溶解，隨后將其定容于100 mL容量瓶中。然后從中分別取出1、2、3、4、5、6 mL溶液，置25 mL容量瓶中，用體積分數70%乙醇定容至刻度，在波長327 nm處測各樣品吸光度。以吸光度作為縱坐標，標準溶液濃度作為橫坐標，進行線性擬合，其標準方程為：y=0.031 87x-0.012 72（R2=0.999 3）。

1.2.3.2 金銀花中綠原酸含量計算

依據“1.2.2”步驟對金銀花中綠原酸進行提取，將提取液定容至250 mL容量瓶中，從中移取2 mL溶液定容至50 mL容量瓶中。在波長327 nm處，測定其吸光度，將吸光度代入標準方程中，計算得出樣品中綠原酸濃度，然后將其樣品中綠原酸濃度代入方程（1）中，即可計算得出綠原酸提取率（Y）。

式中：C為樣品溶液濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；

n為稀釋倍數；m為金銀花粉末的質量，g。

1.2.4 單因素試驗設計

選擇超聲-酶輔助提取法提取金銀花綠原酸，操作步驟同“1.2.2”。稱取5 g金銀花粉末，分別從超聲功率、提取時間、提取溫度、果膠酶添加量和乙醇體積分數5個因素進行單因素試驗，討論試驗因素對樣品綠原酸提取率的影響。超聲功率分別為100、150、200*、250、300 W；提取時間分別為10、20、30*、40、50 min；提取溫度分別為30、35、40*、45、50℃；果膠酶添加量分別為0.10%、0.15%、0.20%*、0.25%和0.30%；乙醇體積分數分別為40%、50%、60%*、70%和80%。每組試驗重復3次，結果用平均值±標準差表示。其中：“*”表示當考察其他因素對綠原酸提取率影響時，用“*”標記的因素保持恒定水平。

1.2.5 響應面法試驗設計

本研究選擇試驗自變量分別為超聲功率（X1）、提取溫度（X2）、果膠酶添加量（X3）和乙醇體積分數（X4），同時選取綠原酸提取率（Y）為響應值。利用Design Expert 8.0軟件設計Box-Behnken組合試驗，本研究的試驗因素與水平如表1所示。

表1 試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of experimental design

采用響應面分析法得到的二次回歸模型，如式（2）所示：

式中：b0為截距回歸系數；bi為線性回歸系數；bii為二次項的回歸系數；bij為交互項的回歸系數；Xi、Xj為自變量。

1.2.6 遺傳算法設計

GA是一種基于自然遺傳和選擇機制的隨機非線性優化算法。采用RSM模型作為遺傳算法的適應度函數，對綠原酸提取率的提取工藝進行優化。選擇高斯變異函數為每個向量條目添加一個隨機數，在原始得分的基礎上，采用秩-量函數對個體進行擬合。優化過程中選擇隨機均勻函數和分散交叉函數，采用Matlab R2018b版遺傳算法工具箱進行優化研究。目標函數如式（3）所示。

式中：f（x）是從RSM模型得到的目標函數；x是輸入向量；y是綠原酸提取率，%；XiL和XiU分別是Xi的下邊界和上邊界。

1.2.7 抗氧化活性的測定

1.2.7.1 ABTS+自由基清除能力的測定

參照Liang等[9]的方法并略作改動。分別將金銀花綠原酸提取物配制成質量濃度為1、3、5、7、9、11 mg/mL的樣品溶液。將7.0 mmol/L ABTS與終濃度為2.45 mmol/L過硫酸鉀充分混合，在25℃條件下，避光靜置12 h。利用pH為4.5的乙酸鈉溶液稀釋至波長734 m處的吸光度為0.7±0.02。取3 mL上述溶液與20 mL樣品溶液混合，靜置6 min，在波長734 nm處測定每個樣品的吸光度，以VC為對照，依據式（4）計算ABTS+自由基的清除率。

式中：Ac為對照品的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.2.7.2 羥基自由基清除能力的測定

參照Wu等[10]的方法并略作改動。分別將金銀花綠原酸提取物配制成質量濃度為1、3、5、7、9、11 mg/mL的樣品溶液。分別取1 mL上述不同濃度的樣品溶液于20 mL具塞玻璃瓶中，依次加入1 mL 7.0 mmol/L FeSO4溶液和1 mL 6.0 mmol/L H2O2溶液，混合均勻，靜置10 min，然后加入1 mL 6.0 mmol/L水楊酸溶液，充分混合，靜置30 min后，在波長510 nm處測定每個樣品的吸光度。以乙醇溶液代替待測液作空白，測定吸光度，以VC為對照，依據式（5）計算羥基自由基清除率。

式中：A0為無水楊酸時樣品液的吸光度；A1為對照品的吸光度；A為空白對照的吸光度。

1.2.8數據處理

本研究所有試驗均重復3次，試驗結果采用平均值±標準差表示；采用Statistics 8.0軟件和Origin 9.0軟件分別對試驗數據進行顯著性分析和作圖；利用Design Expertver 8.0軟件和Matlab R 2018b軟件分別對組合試驗進行設計和提取工藝優化。

2 結果與分析

2.1 超聲功率對綠原酸提取率的影響

由圖1可知，當超聲功率在100～200 W范圍內，隨超聲功率的增加，綠原酸提取率呈顯著升高趨勢（P＜0.05）。其原因是隨超聲功率增加，超聲“空化效應”增強，傳質阻力降低，擴散系數增加，有利于綠原酸溶出[11]。當超聲功率超過200 W，繼續增加超聲功率，綠原酸提取率呈顯著降低的趨勢（P＜0.05）。其原因是較大的超聲功率可能會破壞綠原酸結構，同時也會提高雜質在萃取溶劑中的溶解度，故造成綠原酸提取率降低[12]。綜合考慮，本試驗選擇超聲功率為100、150、200 W進行后續響應面優化試驗。

圖1 超聲功率對綠原酸提取率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic powers on extraction rates of chlorogenic acid

2.2 提取時間對綠原酸提取率的影響

由圖2可知，當提取時間在10～30 min范圍內，隨提取時間延長，綠原酸提取率顯著升高（P＜0.05）。這歸因于在提取初期，金銀花顆粒細胞內外綠原酸濃度存在較大差異，促進綠原酸由內向外擴散，從而提高綠原酸提取率[11]。當提取時間超過30 min時，隨提取時間延長，綠原酸提取率無顯著變化。這是因為當提取時間超過30 min時，絕大多數綠原酸被提取出來，因此，延長萃取時間對綠原酸提取率無顯著變化。綜合考慮，本試驗選擇提取時間為30 min。

圖2 提取時間對綠原酸提取率的影響Fig.2 Effects of extraction time on extraction rates of chlorogenic acid

2.3 提取溫度對綠原酸提取率的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，綠原酸提取率呈現先顯著升高后顯著下降的趨勢（P＜0.05）。當提取溫度為35℃時，綠原酸提取率取最大，為11.63%±0.24%。其原因是隨著提取溫度的升高，一方面增加果膠酶催化活性，有助于破壞植物細胞壁，降低綠原酸傳質阻力；另一方面溫度升高提高了綠原酸的溶解度和擴散系數，從而有利于綠原酸的提取[13]。但當提取溫度過高時，高溫一方面降低或滅活果膠酶活性；此外高溫破壞綠原酸結構，從而降低綠原酸提取率[14]。綜合考慮，本試驗選擇提取溫度為30、35、40℃進行后續響應面優化試驗。

圖3 提取溫度對綠原酸提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperatures on extraction rates of chlorogenic acid

2.4 果膠酶添加量對綠原酸提取率的影響

由圖4可知，當果膠酶添加量在0.10%～0.20%時，隨果膠酶添加量的增加，綠原酸提取率呈現顯著升高的趨勢（P＜0.05）。其原因是隨果膠酶添加量的增加，單位時間內果膠酶催化能力增強，使得金銀花細胞壁發生不同程度的降解，綠原酸傳質阻力顯著降低，有利于綠原酸的提取[15]。但當果膠酶添加量超過0.20%時，隨果膠酶添加量的增加，綠原酸提取率顯著降低（P＜0.05）。其原因是果膠酶添加量過高，金銀花細胞壁破壁越徹底，此時溶劑會溶解過多的雜質，使得綠原酸溶解度降低，不利于綠原酸提取[16]。綜合考慮，選擇果膠酶添加量0.15%、0.20%、0.25%進行后續響應面優化試驗。

圖4 果膠酶添加量對綠原酸提取率的影響Fig.4 Effects of pectinase additions on extraction rates of chlorogenic acid

2.5 乙醇體積分數對綠原酸提取率的影響

由圖5可知，當乙醇提取分數在40%～60%范圍內，隨著乙醇體積分數的增加，綠原酸提取率呈顯著升高趨勢（P＜0.05）。當乙醇體積分數增加到60%時，此時綠原酸提取率取得最大值，為11.37%±0.13%。這歸因于乙醇體積分數為60%時，乙醇極性與綠原酸極性相似，故此時綠原酸溶解度最大，進而使提取率取得最大值[11]。但繼續增加乙醇體積分數，綠原酸提取率呈顯著降低的趨勢（P＜0.05）。其原因是高濃度乙醇會溶解醇溶性雜質和色素等，從而降低了綠原酸的溶解度，造成提取率降低[17]。綜上考慮，選擇乙醇體積分數50%、60%、70%進行后續響應面優化試驗。

圖5 乙醇體積分數對綠原酸提取率的影響Fig.5 Effects of ethanol volume fractions on extraction rates of chlorogenic acid

2.6 響應面試驗結果

2.6.1 模型建立與顯著性檢驗

響應面試驗方案和結果如表2所示。對自變量與響應值進行多元回歸擬合分析，得到試驗因素與響應值的回歸模型，該模型如式（6）所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results

對模型進行方差分析，結果如表3所示。

由表3可知，本試驗所得回歸模型的R2=0.999 8，F=6 005.45，P＜0.000 1，表明所建的回歸方程極顯著。失擬項P=0.088 1＞0.05，說明回歸模型失擬項不顯著。綜上分析可知，回歸模型擬合充分，模型可靠，進一步表明利用該模型可以預測不同提取條件下金銀花綠原酸提取率。

利用F值大小可以判斷各因素對響應值的影響程度，F值越大，因素對響應值的影響越顯著。由表3知，F（X1）=3 527.60、F（X2）=4 316.69、F（X3）=1 575.31和F（X4）=2 818.09，即各因素對金銀花綠原酸提取率的影響順序為提取溫度（X2）＞超聲功率（X1）＞乙醇體積分數（X4）＞果膠酶添加量（X3），且這4個因素對金銀花綠原酸提取率的影響均達到極顯著水平（P＜0.01）。

表3 金銀花綠原酸工藝優化回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model of chlorogenic acid process optimization of honeysuckle

圖6 反映了各試驗因素交互作用對金銀花綠原酸提取率的影響。由表3方差分析結果可知，X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4和X3X4的交互作用均對金銀花綠原酸提取率有極顯著影響（P＜0.01）。由圖6A、6C、6E、6G、6I和6K可知，金銀花綠原酸提取率存在極值點。圖6B、6D、6F、6H、6J和6L均呈現橢圓型，表明X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4和X3X4的交互作用均顯著影響金銀花綠原酸提取率。綜上可知，對金銀花綠原酸提取率影響因素順序為提取溫度（X2）＞超聲功率（X1）＞乙醇體積分數（X4）＞果膠酶添加量（X3），該結果與方差分析的結果一致。

圖6 各因素交互作用對綠原酸提取率影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface plots and contour maps showing interaction effects between every two parameters on the extraction rab of chlorogenic acid

2.6.2 綠原酸提取工藝參數優化

采用Matlab R 2018b軟件對提取工藝進行優化，其結果如7所示。由圖7可知，當運算迭代86次，綠原酸提取率取得最大值，此時試驗因素（超聲功率、提取溫度、果膠酶添加量和乙醇體積分數）編碼分別為0.147、-0.124、0.06、0.117，對應的因素水平分別為157.35 W、34.38℃、0.203%和61.17%，此時綠原酸提取率的理論值為13.07%。

圖7 遺傳算法優化結果Fig.7 The results optimized by genetic algorithm

2.6.3 驗證試驗

采用響應面耦合遺傳算法優化綠原酸提取工藝參數為：超聲功率157.35 W、提取溫度34.38℃、果膠酶添加量0.203%和乙醇體積分數61.17%，在此條件下，綠原酸提取率的理論值為13.07%。考慮實際情況，將上述參數進行修正：超聲功率157 W、提取溫度34℃、果膠酶添加量0.20%和乙醇體積分數61%，在此條件下，綠原酸提取率為12.85%±0.37%，試驗值和理論值的相對誤差為1.68%。表明響應面耦合遺傳算法可以較好地模擬和預測不同提取條件下的綠原酸提取率。

2.7 抗氧化活性研究

2.7.1 ABTS+自由基清除能力的結果分析

ABTS經過氧化劑氧化后生成性質穩定的藍綠色ABTS+自由基，當有抗氧化劑加入時，ABTS+自由基與抗氧化劑發生反應，使得藍綠色褪色或消失[18]。因此，通過測定反應液吸光度的變化，可以反應樣品的抗氧化能力的強弱。由圖8可知，隨金銀花綠原酸提物和VC質量濃度的增加，ABTS+自由基清除率顯著增加（P＜0.05），且呈濃度依賴性。對上述數據進行回歸分析可知，金銀花綠原酸提物和VC對ABTS+自由基清除率的IC50分別為（6.18±0.07）mg/mL和（8.79±0.05）mg/mL。IC50值越小，說明物質的抗氧化活性越強，對比金銀花綠原酸提物和VC的IC50值可知，金銀花綠原酸提物抗氧化活性顯著高于VC（P＜0.05）。

圖8 金銀花提取物和VC對ABTS+自由基清除能力的影響Fig.8 Effects of honeysuckle extract and VC on ABTS+radical scavenging ability

2.7.2 羥基自由基清除能力的結果分析

羥基自由基屬于活性較強的自由基，幾乎可以與細胞內的所有有機物發生反應，造成DNA和細胞膜損傷等變化[19]。因此，羥基自由基的清除能力是抗氧化活性評價中最重要的指標之一。由圖9可知，隨著金銀花綠原酸提取物和VC質量濃度的增加，其對羥基自由基清除率呈顯著上升趨勢（P＜0.05），且呈濃度依賴性。對上述數據進行回歸分析可知，金銀花綠原酸提取物和VC對羥基自由基清除率的IC50值分別為（4.75±0.06）mg/mL和（6.82±0.04）mg/mL。對比金銀花綠原酸提取物和VC對羥基自由基清除率的IC50值可知，金銀花綠原酸提物抗氧化能力優于VC。結果進一步表明金銀花綠原酸提取物是較好的天然抗氧化劑。

圖9 金銀花提取物和VC對羥基自由基清除能力的影響Fig.9 Effects of honeysuckle extract and VC on hydroxyl radical scavenging ability

3 結論

本研究通過響應面耦合遺傳算法優化超聲-酶輔助提取金銀花綠原酸工藝，得到最優工藝參數為：超聲功率157 W，提取時間30 min，提取溫度34℃，果膠酶添加量0.20%，乙醇體積分數61%，在此條件下所得綠原酸提取率為12.85%±0.37%。金銀花綠原酸提物對ABTS+自由基和羥基自由基清除率的IC50值分別為（6.18±0.07）mg/mL和（4.75±0.06）mg/mL。研究結果為金銀花綠原酸提取提供了綠色可行的方法，同時為天然抗氧化劑的開發提供一定的參考借鑒。