果蔗中百菌清殘留特征研究

楊 玲，李復(fù)琴，沈石妍，高欣欣，鄧 軍，張躍彬，刀靜梅

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 開遠(yuǎn)661699）

果蔗是一種以莖汁供鮮食的水果甘蔗，果蔗汁口感甜蜜、味道清香、水分充足，含有豐富的碳水化合物。果蔗富含多種對(duì)促進(jìn)人體新陳代謝有益的維生素和有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)成分，食用后具有提神醒腦、清痰止咳等作用[1]。我國(guó)果蔗產(chǎn)地主要分布在廣東、廣西、浙江、福建等省（區(qū)）[2]，云南省的元江、紅河、元陽等低海拔河谷地帶均有種植。果蔗成熟時(shí)從主產(chǎn)地向全國(guó)各地銷售，供果蔗喜好者消費(fèi)食用，運(yùn)輸時(shí)間加銷售時(shí)間一般在5 d以上。

百菌清屬于低毒殺菌劑[3]，是一種取代苯類的廣譜性殺真菌劑[4]。它能和真菌里的三磷酸甘油醛脫氫酶中一種叫半胱氨酸的蛋白質(zhì)相結(jié)合，達(dá)到抑制真菌中酶活力的目的，致使真菌細(xì)胞的代謝能力受阻而逐漸喪失生命力[5]。百菌清不具備內(nèi)吸傳導(dǎo)功能，藥物無法從噴藥位置及農(nóng)作物的根系吸收，但噴灑到農(nóng)作物上后，在植物表面有很好的吸附力，耐雨水沖洗，所以能延長(zhǎng)藥效的保持時(shí)間[6]。百菌清吸進(jìn)人體有較強(qiáng)的毒性，會(huì)刺激呼吸系統(tǒng)，同時(shí)有一定的致癌作用[7]，誤入眼睛會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重危害，通過皮膚接觸容易導(dǎo)致過敏，對(duì)魚類等水生生物毒性極大，進(jìn)入水域系統(tǒng)將會(huì)受到諸多影響，產(chǎn)生惡劣后果。

本研究對(duì)市售果蔗噴施不同濃度（100～500倍液）的百菌清可濕性粉劑，以期了解百菌清在堆儲(chǔ)果蔗的果蔗汁中的殘留變化，評(píng)估其安全使用量和使用時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用果蔗為云南主栽果蔗品種——黃皮果蔗（粵糖54-474），種植地為云南省玉溪市元江縣。

百菌清標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；乙腈、正己烷，默克股份兩合公司；丙酮（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，用烘箱140℃烘烤4 h；濾膜（0.2 μm）,有機(jī)溶劑膜，津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；固相萃取柱，弗羅里矽柱，容積6 mL，填充物1 000 mg。

百菌清為江西某農(nóng)化有限公司生產(chǎn)的可濕性粉劑，有效成分含量75%，包裝袋上推薦使用400～600倍液制劑用藥量。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GC-2014氣相色譜儀，有電子捕獲檢測(cè)器（ECD），日本島津公司；LCZ-80型甘蔗壓榨機(jī)，廣東樂創(chuàng)電器有限公司；XW-80型旋渦混勻器，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；FHS-2型高速勻漿機(jī)，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；WD-12型恒溫水浴氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司；PL2002/01型電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 果蔗預(yù)處理

試驗(yàn)用果蔗于2019年10月21日從當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購買，果蔗在試驗(yàn)前經(jīng)檢測(cè)未檢出百菌清。試驗(yàn)百菌清濃度為5水平，分別稱取10、5、3.3、2.5、2 g 75%百菌清可濕性粉劑于燒杯中，溶于1 000 mL水中，依次配制出100、200、300、400、500倍百菌清溶液。100 kg果蔗噴施1 L百菌清溶液。

噴灑各濃度保鮮劑后的果蔗，待蔗皮上的百菌清溶液干透，分別堆儲(chǔ)到室溫25℃的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，每3 d取樣1次，共取樣13次，整個(gè)試驗(yàn)周期為39 d。39 d后，果蔗外觀干縮，刀口斷面發(fā)紅，蔗汁有酒味，無法入口食用。

1.2.2 樣品制備

樣品制備時(shí)，去除果蔗的頭尾兩端，削皮，放入不銹鋼甘蔗壓榨機(jī)內(nèi)，榨出果蔗汁，裝入樣品瓶中，于-20℃的冰箱中保存，待測(cè)。

1.2.3 樣品提取

以NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測(cè)定》[8]為檢測(cè)依據(jù)。稱取25.0 g待測(cè)果蔗汁于100 mL錐形瓶?jī)?nèi)，加入50.0 mL乙腈，在勻漿機(jī)中高速勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有5～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，收集濾液40～50 mL，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，然后在室溫下靜置30 min，使乙腈相與水相分層。

1.2.4 凈化

從100 mL具塞量筒中吸取10.00 mL乙腈溶液，放入50 mL燒杯中，將燒杯放在80℃水浴鍋中加熱，杯內(nèi)緩緩?fù)ㄈ氲獨(dú)猓舭l(fā)近干，加入2.0 mL正己烷，蓋上鋁箔，待凈化。將弗羅里矽柱依次用5.0 mL丙酮+正己烷（V丙酮∶V正己烷=1∶9，下同）、5.0 mL正己烷預(yù)淋洗，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即倒入上述待凈化溶液，用15 mL刻度離心管接收洗脫液，用5 mL丙酮+正己烷沖洗燒杯后淋洗弗羅里矽柱，并重復(fù)一次。將盛有淋洗液的離心管置于氮吹儀上，在水浴溫度50℃條件下，氮吹蒸發(fā)至小于5 mL，用正己烷定容至5.0 mL，在旋渦混合器上混勻，移入2 mL自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，待測(cè)。

1.2.5 色譜條件

色譜柱：50%聚苯基甲基硅氧烷（DB-17）柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度：200℃；檢測(cè)器溫度：320℃；柱溫：起始溫度150℃，保持2 min，以6℃/min升至270℃，保持8 min；載氣：氮?dú)猓兌取?9.999%，流速為1 mL/min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比10∶1。以上述色譜條件，百菌清標(biāo)準(zhǔn)樣品（1 μg/mL）出峰時(shí)間為15.225 min（見圖1）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard sample

1.2.6 定性分析

雙柱測(cè)得的樣品溶液中未知組分的保留時(shí)間（RT）分別與標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一色譜柱上的保留時(shí)間（RT）相比較，如果樣品溶液中某組分的兩組保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中某一農(nóng)藥的兩組保留時(shí)間相差均在±0.05 min內(nèi)，即可認(rèn)定為該農(nóng)藥。

1.2.7 定量分析

試樣中被測(cè)農(nóng)藥殘留量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（ω）計(jì)，單位以mg/kg表示。

式中：ρ為標(biāo)準(zhǔn)溶液中農(nóng)藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/L；A為樣品溶液中被測(cè)農(nóng)藥的峰面積；AS為農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)農(nóng)藥的峰面積；V1為提取溶劑總體積，mL；V2為吸取出用于檢測(cè)的提取溶液的體積，mL；V3為樣品溶液定容體積，mL；m為試樣的質(zhì)量，g。

計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，當(dāng)結(jié)果大于1 mg/kg時(shí)保留3位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 果蔗汁中不同濃度百菌清殘留特征

由圖2可見，在39 d試驗(yàn)中，噴施百菌清100倍液果蔗的果蔗汁中百菌清含量變化不明顯，保持在0.79～1.24 mg/kg。雖然噴施的百菌清含量（10 g/L）很高，但果蔗汁中檢出的殘留量卻偏低，這與制備樣品時(shí)削去果蔗皮后才榨取果蔗汁有關(guān)。百菌清是一種不具備內(nèi)吸傳導(dǎo)作用的殺菌性農(nóng)藥[9]，且在果蔗皮上有很強(qiáng)的附著性[10]。因此，楊玲等[11]研究表明，果蔗中百菌清主要?dú)埩粼诠崞ど希夜崞ど系臍埩袅窟h(yuǎn)遠(yuǎn)高于果蔗汁。試驗(yàn)于2019年10月21日噴施百菌清100倍液，3 d后榨出的果蔗汁中百菌清含量為0.91 mg/kg，其氣相色譜圖見圖3。

圖2 果蔗汁中不同濃度百菌清含量隨堆儲(chǔ)時(shí)間的變化Fig.2 Contents changes of chlorothalonil at different concentrations in fruit sugarcane juice with storage time

圖3 樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of sample

相比較噴施100倍液的果蔗汁而言，噴施200倍液果蔗汁中的百菌清殘留含量明顯減少，在0.37～0.67 mg/kg，最高值出現(xiàn)在噴施后的21 d，整體降解進(jìn)程緩慢。

由圖2可以看出，噴施百菌清300倍液的果蔗在堆儲(chǔ)3 d時(shí)百菌清殘留量為0.14 mg/kg；之后的21 d呈緩慢上升趨勢(shì)，至堆儲(chǔ)27 d時(shí)殘留量達(dá)到了最高值，為0.30 mg/kg；隨后開始下降，至堆儲(chǔ)39 d時(shí)降至0.13 mg/kg。噴施百菌清300倍液的果蔗在堆儲(chǔ)過程中果蔗中百菌清殘留量顯著低于噴施100、200倍液組（P＜0.05）。

噴施百菌清400倍液的果蔗汁中的百菌清殘留量略低于噴施300倍液的果蔗汁。其最高含量出現(xiàn)在堆儲(chǔ)的第24天，為0.21 mg/kg；而最低值出現(xiàn)在堆儲(chǔ)3 d和39 d時(shí)，也是本次試驗(yàn)的第1次和最后1次取樣，含量均為0.10 mg/kg。

噴施百菌清500倍液3 d和6 d時(shí)，果蔗汁中百菌清殘留量均為0.10 mg/kg，之后一直以0.11 mg/kg保持至第24天，堆儲(chǔ)27 d時(shí)果蔗汁中百菌清殘留量最高，為0.18 mg/kg，之后開始緩慢下降，至堆儲(chǔ)第39天降至0.07 mg/kg。

2.2 檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和精密度

目前，測(cè)定百菌清的常用方法有氣相色譜法和液相色譜法[12]。因液相色譜法具有設(shè)備價(jià)格昂貴，成本偏高，精確度低等缺點(diǎn)，沒有得到廣泛應(yīng)用[13]。所以本文采用氣相色譜法，以NY/T 761—2008[8]為依據(jù)。果蔗汁前處理加乙腈溶劑高速勻漿提取[14]，利用水浴氮吹儀進(jìn)行濃縮，經(jīng)弗羅里矽柱過柱凈化后，采用氣相色譜儀檢測(cè)。加標(biāo)回收率試驗(yàn)的結(jié)果和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值見表1。

表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Labeled recovery test results

稱取25.0 g果蔗汁于100 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入0.04、0.24、0.64、1.24 μg/mL百菌清標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過提取、凈化，上氣相色譜儀重復(fù)測(cè)定3次，加標(biāo)色譜圖見圖4。結(jié)果顯示：加標(biāo)平均回收率為100%～103%，RSD值為0.24%～1.71%。從加標(biāo)回收率和RSD值可以看出，該檢測(cè)方法前處理操作簡(jiǎn)單、容易掌握，使用氣相色譜法檢測(cè)具有靈敏度高、處理數(shù)據(jù)便捷等明顯優(yōu)勢(shì)，完全能適用于本試驗(yàn)中果蔗汁百菌清殘留量的測(cè)定。

圖4 加標(biāo)回收色譜圖Fig.4 Labeled recovery chromatogram

3 結(jié)論與討論

在噴施百菌清100、200、300、400、500倍液的果蔗的果蔗汁中，施用100、200倍液的果蔗汁中百菌清殘留量明顯較高，殘留量為0.37～1.24 mg/kg，噴施300、400、500倍液的果蔗汁中，百菌清殘留量最高值為0.30 mg/kg，最低值僅為0.07 mg/kg，且這3個(gè)稀釋濃度處理果蔗汁中百菌清殘留量都很接近。各濃度百菌清在果蔗中的降解速度都很緩慢，試驗(yàn)前期都是由低到高慢慢積累，逐步上升，中后期才達(dá)到高峰值，30 d后開始呈下降趨勢(shì)。這與陳莉等[15]研究的在大田露天條件下噴施百菌清后呈階梯式下降的降解趨勢(shì)有所不同。這可能與果蔗噴施百菌清后存放在密閉的室內(nèi)，沒有日曬和對(duì)流的風(fēng)，未經(jīng)雨水、露水的沖刷有關(guān)。

果蔗汁中百菌清最高殘留值出現(xiàn)在噴施百菌清100倍液后的第18天，其殘留量為1.24 mg/kg，而在GB 2763—2019[16]中，沒有明確規(guī)定果蔗的最大殘留限量，本文以西瓜為參考，其百菌清的最大殘留為5 mg/kg。本試驗(yàn)中果蔗是削去外皮后才榨取汁液檢測(cè)，大多數(shù)百菌清殘留物是附著在果蔗皮上，只有少量百菌清沿著砍收時(shí)的頭尾兩端傷口緩緩進(jìn)入果蔗中，造成少量的殘留。這與王吉騰等[17]在測(cè)定梨中百菌清殘留結(jié)果一致，即百菌清在梨的果皮上被測(cè)出，而梨果肉中未被測(cè)出，百菌清主要吸附在梨皮表面，且沒有任何內(nèi)吸傳導(dǎo)功能。王靜等[18]也認(rèn)為種植在大棚內(nèi)的黃瓜，百菌清主要?dú)埩粼邳S瓜皮上，百菌清含量高的黃瓜經(jīng)過削皮后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)百菌清含量明顯降低。因此，建議鮮食果蔗時(shí)，用刀削去外皮后再吃，盡量避免用嘴直接去皮食用。