呼出氣一氧化氮水平 外周血ADAM8表達與兒童哮喘急性發作嚴重程度的相關性分析

郭先鋒 張向峰 郭長根 蘇愛芳 樊曉平

支氣管哮喘是以慢性氣道炎癥為特點的異質性疾病，兒童多發，占全部支氣管哮喘的2%～7%。隨病情進展可能出現支氣管痙攣、缺氧及呼吸困難，嚴重者可能出現呼吸衰竭，造成不良預后。準確對支氣管哮喘患兒進行病情評估，選擇針對性治療方案對控制哮喘急性發作有積極的意義。支氣管鏡下黏膜活檢及肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞計數被認為是診斷呼吸道炎癥的金標準，但均為介入操作，兒童耐受性差、配合度欠佳、家長無法接受。近年來，呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide，FeNO)水平被認為與氣道高反應性、哮喘炎癥浸潤存在緊密關聯，且FeNO篩查無創、可重復性好、經濟性高，可作為評估氣道炎癥的有效參數。去整合素金屬蛋白酶8(adisintegrin metalloproteinase 8，ADAM8)為哮喘相關易感基因，哮喘患兒唾液細胞可檢出高水平ADAM8 mRNA。推測FeNO、ADAM8可能與支氣管哮喘發病及進展存在一定的關聯，但對兩者用于評估支氣管急性發作病情嚴重程度的價值鮮見報道。本研究對不同嚴重程度支氣管哮喘急性發作期的FeNO、血ADAM8及肺功能進行檢測，并與緩解期支氣管哮喘患兒及正常健康兒童進行對比，分析上述指標在支氣管哮喘急性發作期及病情進展中的變化及其與肺功能的關系，以期為支氣管哮喘防治及合理對癥治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2018年7月至2019年11月漯河市第二人民醫院收治的支氣管哮喘急性發作期患兒96例作為急性組。按2∶1比例將門診同期收治支氣管哮喘緩解期48例及同期體檢的非哮喘健康兒童48例分別作為緩解組與對照組。急性組納入標準：年齡3～14歲；符合兒童支氣管哮喘診斷與防治指南中支氣管哮喘急性發作期診斷標準；支氣管激發或運動試驗陽性；支氣管舒張試驗陽性；日晚間最大呼氣流量(peak expiratory flow，PEF)變異超過20%；臨床資料完整。緩解期患兒滿足上述指南中支氣管哮喘緩解期標準，經治療后癥狀基本消失，呼吸相延長，肺部哮鳴音體征消失，PEF恢復超過預計值80%，持續12周以上。排除標準：其他疾病所致氣急、喘息、咳嗽或胸悶癥狀；嚴重心肝腎疾病；結締組織病、風濕病；過敏性鼻炎；皮膚過敏史；急慢性傳染疾病；2周內上呼吸道感染史；自身免疫疾病；全身血液系統疾病；入組12周內接受激素類或免疫抑制劑類藥物治療；藥物過敏史；合并惡性腫瘤。對照組經體檢證實體健，近期無呼吸系統感染史，無過敏史。急性發作期支氣管哮喘患兒參照病情分度標準分為輕度組(

n

=31)、中度組(

n

=37)與重度組(

n

=28)。

1.2 方法

1.2.1 血標本采集 急性組于入院當日未治療前、緩解組與對照組于體檢當日采集肘靜脈血4 mL，室溫靜置0.5 h，1 000 r/min離心15 min，分離血清，低溫保存待測。

1.2.2 FeNO檢查 瑞典艾瑞科公司NIOX型呼出氣一氧化氮檢測系統檢測FeNO，參照指南中FeNO標準化程序進行檢測，要求受試兒童口含1次性細菌過濾器及一氧化氮過濾器，深吸氣后以一定呼氣流速勻速呼吸維持10 s左右，確保死腔氣體廓清且達到穩定可測平臺期后行FeNO分析。

1.2.3 ADAM8檢測 外周血熒光定量聚合酶鏈反應(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測ADAM8，Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，Trizol RNA抽提試劑盒(瑞士羅氏公司)提取外周血單個核細胞總RNA合成cDNA。ADAM8上下游引物序列分別為：5’-GGGAGAAACAACGAAGTTG-3’，5’-GGTGTGATCAAGCACAGAT-3’，內參β-actin上下游引物序列分別為：5’-GTGACGTGGACAATCCGCAAG-3’，5’-GGAAGGTGGACAACGGACGC-3’(引物均由上海生工生物工程有限公司設計及合成)。RT-PCR反應體系：0.5 μL cDNA+5 μL SYBR Green Master Mix+上下游引物各0.4 μL+雙蒸水補足至10 μL。美國Bio-Rad公司CFX96型RT-PCR儀進行擴增反應，反應條件：95℃預變性120 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40個循環，參照2公式計算ADAM8 mRNA相對表達量。

1.2.4 肺功能測定 德國耶格公司 MasterScreen paed型小兒肺功能測定儀測定受試兒童肺功能，包括用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、1秒用力呼氣量(forced expiratory in one second，FEV1)、FEV1/FVC%、PEF。

2 結果

2.1 3組研究對象資料比較 急性組、緩解組、對照組性別、年齡、身體質量指數對比差異均無統計學意義(

P

>0.05)。見表1。

表1 3組研究對象基線資料比較

2.2 3組研究對象FeNO、外周血ADAM8 mRNA及肺功能比較 急性組、緩解組FeNO、ADAM8 mRNA高于對照組(

P

<0.05)，FVC、FEV1、FEV1/FVC%、PEF低于對照組(

P

<0.05)，急性組FeNO、ADAM8 mRNA高于緩解組，FVC、FEV1、FEV1/FVC%、PEF低于緩解組(

P

<0.05)。見表2。

表2 3組研究對象FeNO、外周血ADAM8 mRNA及肺功能比較

2.3 不同程度急性發作期支氣管哮喘患兒FeNO、外周血ADAM8 mRNA及肺功能比較 中度組、重度組FeNO、ADAM8 mRNA高于輕度組(

P

<0.05)，FVC、FEV1、FEV1/FVC%、PEF低于輕度組(

P

<0.05)；重度組FeNO、ADAM8 mRNA高于中度組，FVC、FEV1、FEV1/FVC%、PEF低于中度組(

P

<0.05)。見表3。

表3 不同嚴重程度急性發作期支氣管哮喘患兒FeNO、外周血ADAM8 mRNA及肺功能比較

2.4 急性發作期支氣管哮喘患兒FeNO、ADAM8 mRNA與肺功能關系 FeNO與ADAM8呈正相關(

P

<0.05)，FeNO、ADAM8與FVC、FEV1、FEV1/FVC%、PEF均呈負相關(

P

<0.05)。見表4。

表4 急性發作期支氣管哮喘患兒FeNO、ADAM8 mRNA與肺功能關系(n=96)

2.5 FeNO、ADAM8預測支氣管哮喘急性發作的ROC分析 依據診斷試驗中敏感度與假陽性率(1-特異性)繪制ROC曲線，結果顯示FeNO與ADAM8兩者中ADAM8預測支氣管哮喘急性發作價值更高，約登指數最大時，對應截斷值為1.17，曲線下面積(area under curve，AUC)為0.915，敏感度、特異性分別為90.41%、87.50%；FeNO約登指數最大時截斷值為45.92 ppb，AUC為0.790，敏感度、特異性分別為94.52%、75.00%，兩者預測價值對比差異無統計學意義(面積差異：0.125，標準誤差：0.072，95%CI：-0.017～0.267，

Z

=1.731，

P

=0.084)。見表5、圖1。

表5 FeNO、ADAM8預測支氣管哮喘急性發作的ROC分析

圖1 FeNO、ADAM8預測支氣管哮喘急性發作的ROC曲線

3 討論

全球支氣管哮喘患病率仍處于上升階段，尤其兒童哮喘占比較高。探究支氣管哮喘急性發作特點、病理病機對哮喘防治有積極意義。FeNO作為氣道炎癥及哮喘發作無創檢測手段，逐漸推廣應用于哮喘診治中。高永偉等發現，FeNO隨氣道炎癥程度加重而升高。本研究發現，急性組患兒FeNO水平較緩解組及對照組兒童明顯上升，隨哮喘發作嚴重程度及肺功能受損程度的加重而上升，推測FeNO與支氣管哮喘急性發作和哮喘病情進展有關。考慮FeNO主要由嗜酸性粒細胞分泌，存在擴血管及血管舒張作用；氣道炎癥刺激時，嗜酸性粒細胞分泌增多，FeNO隨之上升，趨化炎癥細胞至氣道局部，加重氣道炎癥反應，導致呼吸阻塞加重，誘導支氣管哮喘急性發作。本研究進行相關性分析發現，支氣管哮喘急性發作患兒FeNO與各肺功能參數均呈負相關，ROC分析發現，FeNO截斷值為45.92 ppb時預測支氣管哮喘急性發作敏感度、特異性分別為94.52%、75.00%，有較高的敏感度，可指導支氣管哮喘病情評估。

ADAM是新型依賴性金屬蛋白酶家族I型跨膜蛋白，前期發現與炎癥反應及過敏性氣道反應疾病密切相關。已有動物研究發現，在哮喘小鼠肺實質炎癥浸潤細胞可見ADAM8蛋白濃度上升。本研究發現，支氣管哮喘急性發作期患兒外周血ADAM8 mRNA表達較緩解組及對照組高，隨支氣管哮喘急性發作病情分度的上升而上升，提示ADAM8濃度變化與支氣管哮喘急性發作及病情進展有關，推測ADAM8可能通過趨化炎癥細胞聚集于氣道炎癥部位，促進炎癥細胞增殖、分化，引起氣道高反應性，進而誘導哮喘發作。本研究還發現，支氣管哮喘急性發作時患兒肺功能出現不同程度的損傷，肺通氣功能降低；病情越嚴重的患兒FEV1、FVC、FEV1/FVC%及PEF降低越明顯，且相關性分析發現上述參數與ADAM8呈負相關，這與王開梅等結論相似，提示支氣管哮喘急性發作患兒存在明顯肺功能受損，且ADAM8水平越高，哮喘病情進展速度越快，肺功能受損加重，考慮可將ADAM8作為評估支氣管哮喘急性發作病情嚴重程度的標志物。為驗證該結論，ROC曲線分析顯示，ADAM8預測支氣管哮喘急性發作整敏感度、特異性分別為90.41%、87.50%，提示可將作為監測支氣管哮喘急性發作及病情進展的輔助參考。此外，本研究還發現，支氣管哮喘急性發作患兒FeNO與外周血ADAM8呈正相關，提示兩者或可能協同參與支氣管哮喘急性發作過程。

綜上，支氣管哮喘急性發作期患兒FeNO、外周血ADAM8較緩解期及正常兒童高，且隨哮喘發作嚴重程度上升，均與肺功能呈負相關，有助于指導支氣管哮喘急性發作監測及病情進展評估。但本研究尚未闡明兩者協同參與支氣管哮喘急性發作的確切機制，對其協同影響支氣管哮喘肺功能的機制尚待進一步展開體內外研究論證。