PM2.5對(duì)去勢(shì)后雌性SD大鼠骨微結(jié)構(gòu)micro-CT的影響

林妹珠 黃惠娟 倪清麗 董怡君 劉宗玉 蔡芬 張小蕊

1. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建 福州 350025 2. 福建醫(yī)科大學(xué)福總臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350025 3. 廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院，福建 福州 350025

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是由于雌激素水平下降，骨代謝水平改變導(dǎo)致骨礦密度、骨質(zhì)量下降，骨結(jié)構(gòu)退化、脆性增加，骨微結(jié)構(gòu)改變等一系列變化的全身骨代謝相關(guān)疾病。最新流行病學(xué)調(diào)研指出，美國(guó)約有1 000萬50歲以上的人患有骨質(zhì)疏松癥，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)巨大，在美國(guó)和英國(guó)每年約花費(fèi)179億美元和40億英鎊用于治療[1], 骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)是一個(gè)世界范圍的主要健康問題。PM2.5(particulate matter 2.5)指的是空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm的顆粒物，其成分復(fù)雜，含無機(jī)成分、有機(jī)成分、重金屬等，可直接進(jìn)入人體肺泡，危害健康。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期暴露在PM環(huán)境下，與骨質(zhì)疏松的發(fā)生具有密切相關(guān)性[2]。在骨質(zhì)疏松臨床篩查和診治中，雙能 X 射線吸收測(cè)定法測(cè)量骨密度被公認(rèn)為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是骨密度反映骨量的多少，并不能反映骨微結(jié)構(gòu)的改變情況[3]。顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描術(shù)(micro-computed content，Micro-CT)可以在3 D上測(cè)量骨小梁骨微結(jié)構(gòu)變化，從而對(duì)骨礦物進(jìn)行定量定性分析，對(duì)診斷骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展過程更為敏感和可靠，為臨床研發(fā)骨骼藥物提供更多機(jī)會(huì)[4]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

3周齡約50 g的SPF級(jí)雌性健康SD大鼠24只，由第九○○醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0001。SD大鼠適應(yīng)性生長(zhǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組，低、中、高劑量組，每組6只，進(jìn)行PM2.5懸濁液氣道滴注，每3天滴注1次。其中對(duì)照組滴注生理鹽水，低、中、高劑量組滴注PM2.5懸濁液濃度分別為：35、70、150 μg/m3。在氣道滴注的第5個(gè)月末行去勢(shì)手術(shù)，第九個(gè)月末取材。

1.2 PM2.5懸濁液制備

PM2.5的采集地點(diǎn)為福州市鼓樓區(qū)，使用Thermo Science GUV-15-H-1(美國(guó))大流量采樣器和Thermo Science G1200-41 PM2.5采樣頭，流量1.13 m3/min，用石英纖維膜(美國(guó)Whataman公司)采集PM2.5。采樣前將纖維膜于馬沸爐中450 ℃焙燒5 h，以消除可能載帶的有機(jī)物。每24小時(shí)更換一次纖維膜。將收集好PM2.5的纖維膜剪成1 cm×1 cm大小，加入超純水，置于超聲振蕩器中，4 ℃振蕩2 h后用8層無菌紗布過濾。將過濾好的液體置于無菌離心管內(nèi)，低溫高速離心(4 ℃，12 000 r/min，30 min)后去除上清液，沉淀物質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)干燥12 h。稱重后，加入PBS磷酸鹽緩沖液配置成所需濃度的懸濁液，保存于4 ℃冰箱。

1.3 PM2.5暴露

1.3.1PM2.5暴露濃度標(biāo)準(zhǔn)：PM2.5暴露濃度標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3095-2012)一、二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)24小時(shí)平均年濃度限值(35、75 μg/m3)以及《環(huán)境空氣質(zhì)量指數(shù)(AQI)技術(shù)規(guī)定(試行)》規(guī)定，重度污染的PM2.5濃度大于150 μg/m3。

1.3.2PM2.5氣道滴注：將麻醉好的SD大鼠固定，暴露氣道，用棉簽清理口腔后，用腰麻針套管作為氣道滴注針，向氣道內(nèi)滴注相應(yīng)濃度的PM2.5懸濁液，成功后用2.5 mL針管向氣道內(nèi)注入一管空氣。拔出滴注針，觀察大鼠狀態(tài)良好后放回飼養(yǎng)籠。

1.4 SD大鼠去勢(shì)造模

在PM2.5氣道滴注的第5個(gè)月末，行去勢(shì)手術(shù)。去勢(shì)術(shù)前禁食禁水8 h，手術(shù)器械高壓滅菌。麻醉后取背部切口，逐層切開皮膚、肌肉，分離脂肪后可見粉色卵巢，結(jié)扎輸卵管并切除卵巢后逐層縫合、消毒，觀察出血情況。同法摘除另一側(cè)卵巢。術(shù)后密切觀察大鼠皮膚切口情況，精神狀態(tài)等，在術(shù)后3天內(nèi)定期消毒傷口，肌注青霉素預(yù)防感染，如有傷口裂開則二次縫合。確保手術(shù)成功去卵巢，在取材時(shí)檢查卵巢是否缺失。

1.5 取材

乙醚吸入麻醉處死SD大鼠后，用高壓滅菌后的手術(shù)器械取出其右側(cè)股骨、脛骨以及腰椎，剔除周圍結(jié)締組織及血管神經(jīng)組織等，用生理鹽水浸潤(rùn)紗布包裹標(biāo)本后放入病理袋中，存于-20 ℃冰箱以待micro-CT掃描。

1.6 micro-CT掃描

用micro-CT掃描儀(MCT-Sharp，中國(guó))掃描時(shí)，將脛骨、股骨、腰椎分別沿長(zhǎng)軸固定于固定器內(nèi)，設(shè)置電壓為70 kV，功率7 W，100 μA，4幀疊加，角度增益0.72 °，曝光時(shí)間100 ms，分辨率為20 μm。掃描得到prj格式圖像，重建后生成IMO文件，通過Medproject軟件處理，得到三維圖像及分析結(jié)果。其中選取脛骨距生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端2 mm，層厚1.5 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域進(jìn)行三維重組定量分析；選取股骨Ward三角區(qū)，層厚0.5 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域進(jìn)行三維重組定量分析；選取與上下椎間面等距的，層厚為1.6 mm的椎體骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域進(jìn)行三維重組掃描定量分析。相關(guān)參數(shù)如下：骨小梁骨密度(trabecular bone mineral density，Tb.BMD)、骨體積(bone volume，BV)、松質(zhì)骨感興趣區(qū)域(region of interest，ROI )、總體積(total volume，TV)、相對(duì)骨體積或骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(structure model index，SMI)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation/spacing，Tb.Sp)[5]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 PM2.5暴露組與對(duì)照組脛骨、股骨Ward三角區(qū)、腰椎骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較

2.1.1PM2.5暴露對(duì)雌性SD大鼠脛骨的影響：與對(duì)照組相比，PM2.5暴露組脛骨骨小梁的Tb.BMD減小、BV/TV減小、SMI增大、Tb.Th減小、Tb.N減少、Tb.Sp增加；其中相較于對(duì)照組，脛骨骨小梁的BV/TV、Tb.Th、Tb.N 、Tb.Sp的改變差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Tb.BMD、SMI的改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 各組脛骨骨參數(shù)改變Table 1 The changes of tibial bone parameters in each

2.1.2PM2.5暴露對(duì)雌性SD大鼠股骨Ward三角區(qū)的影響：與對(duì)照組相比，PM2.5暴露組股骨Ward三角區(qū)骨小梁的Tb.BMD減小、BV/TV減小、SMI增大、Tb.Th減小、Tb.N減少、Tb.Sp增加；其中相較于對(duì)照組，股骨Ward三角區(qū)骨小梁的Tb.BMD、BV/TV、SMI、Tb.N 、Tb.Sp的改變差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Tb.Th的改變以及低劑量組BV/TV的改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 各組股骨骨參數(shù)改變Table 2 The changes of femoral bone parameters in each

2.1.3PM2.5暴露對(duì)雌性SD大鼠腰椎的影響：與對(duì)照組相比，PM2.5暴露組腰椎骨小梁的Tb.BMD減小、BV/TV減小、SMI增大、Tb.Th減小、Tb.N減少、Tb.Sp增加；其中相較于對(duì)照組，腰椎骨小梁的SMI、Tb.Th、Tb.N 、Tb.Sp的改變差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Tb.BMD、BV/TV的改變以及低劑量組Tb.Th的改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3。

表3 各組腰椎骨參數(shù)改變Table 3 The changes of vertebral bone parameters in each

2.2 Micro-CT 重建

2.2.1PM2.5暴露對(duì)脛骨骨微結(jié)構(gòu)micro-CT的影響：如圖1所示，各組脛骨髓腔內(nèi)容物稀疏，相比對(duì)照組，脛骨髓腔隨著PM2.5懸濁液濃度的增高而變得更稀疏，甚至高劑量組已完全空虛。從圖1中A2～D2可見，對(duì)照組的骨小梁有少許斷裂不完整，桿狀結(jié)構(gòu)少，多數(shù)為片狀結(jié)構(gòu)，而隨著PM2.5懸濁液暴露濃度增高，骨小梁愈來愈不連續(xù)和缺損，數(shù)量減少，骨小梁之間的間隙變大，骨小梁多數(shù)為桿狀結(jié)構(gòu)。

注：A 對(duì)照組；B 低劑量組；C 中劑量組；D 高劑量組圖1 各組大鼠脛骨及其骨小梁結(jié)構(gòu)的micro-CT三維重建圖Fig.1 Three-dimensional micro-CT reconstruction of the tibia and its trabecular structure in rats of each group。

2.2.2PM2.5暴露對(duì)股骨Ward三角區(qū)骨微結(jié)構(gòu)micro-CT的影響：如圖2所示，股骨近端其股骨頭內(nèi)骨小梁相對(duì)完整，對(duì)照組與低劑量組股骨髓腔內(nèi)骨小梁分布稀疏、相差不大；隨著PM2.5懸濁液暴露濃度的增加，髓腔內(nèi)骨小梁分布稀疏、間隙變大。股骨解剖Ward三角區(qū)的micro-CT三維重建圖2中A4～D4可見，各組骨小梁均為松散不連續(xù)的、間隙變大，但整體上相差不大。

注：A 對(duì)照組；B 低劑量組；C 中劑量組；D 高劑量組。圖2 各組大鼠股骨近端及股骨ward三角區(qū)骨小梁的micro-CT三維重建圖Fig.2 Three-dimensional micro-CT reconstruction of bone trabeculae of the proximal femur and Ward triangle of the femur in rats of each group

2.2.3PM2.5暴露對(duì)腰椎骨微結(jié)構(gòu)micro-CT的影響：如圖3所示，各組腰椎椎體變得稀疏；相對(duì)于對(duì)照組，隨著PM2.5懸濁液暴露濃度增高，腰椎椎體骨間隙變大，完整性破壞甚至斷裂。從圖3中A6-D6可見，隨著PM2.5懸濁液暴露濃度增高，骨小梁變得更加不連續(xù)，間隙增大、數(shù)量減少甚至缺損，桿狀結(jié)構(gòu)增多。

注：A 對(duì)照組；B 低劑量組；C 中劑量組；D 高劑量組。圖3 各組大鼠腰椎及其骨小梁的micro-CT三維重建圖Fig.3 Three-dimensional micro-CT reconstruction of the lumbar vertebrae and its trabeculae in rats of each group

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的特征是骨量減少，骨組織微結(jié)構(gòu)惡化，導(dǎo)致骨脆性增加，繼而增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)，因此早期識(shí)別其發(fā)生具有重要意義。有研究者通過對(duì)去卵巢后的SD大鼠腰椎骨微結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，去勢(shì)后SD大鼠的骨吸收大于骨形成，骨微結(jié)構(gòu)開始改變且在去卵巢后的第12周后才顯現(xiàn)出骨質(zhì)疏松癥狀[6]。本研究參照此方法，在去勢(shì)前后都對(duì)雌性SD大鼠行氣道滴注PM2.5懸濁液，旨在觀察PM2.5是否會(huì)加重雌性SD大鼠絕經(jīng)后骨量減少。

眾多研究表明，空氣中的細(xì)顆粒物PM2.5可以引發(fā)呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多系統(tǒng)疾病而對(duì)骨骼系統(tǒng)的影響及其機(jī)制研究較少。Micro-CT分辨率高、無創(chuàng)，檢測(cè)時(shí)可以精確定位所觀察區(qū)域，因此是研究骨小梁結(jié)構(gòu)的重要工具。本研究的結(jié)果表明，PM2.5暴露使去勢(shì)雌性SD大鼠的脛骨、股骨以及腰椎骨小梁數(shù)量減少和骨小梁分離度增加，脛骨的各組骨微結(jié)構(gòu)差異相對(duì)比較明顯；在股骨和腰椎的骨微結(jié)構(gòu)改變中，相對(duì)于對(duì)照組，中、高劑量組有一定的差異。說明PM2.5暴露對(duì)于去勢(shì)后雌性SD大鼠脛骨骨微結(jié)構(gòu)的改變較為明顯，使骨量減少，而一定濃度的PM2.5暴露也可以改變股骨和腰椎的骨量。由此可見，對(duì)于空氣污染嚴(yán)重的城市，關(guān)注絕經(jīng)后人群骨骼健康尤為重要。

micro-CT三維重建圖中可以更直觀地看出各組間的松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)的顯著差異，有研究者對(duì)骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折進(jìn)行micro-CT影像學(xué)分析，結(jié)果提示micro-CT檢測(cè)對(duì)于骨小梁骨微結(jié)構(gòu)的變化更為敏感和準(zhǔn)確，已經(jīng)是一種廣泛應(yīng)用的無創(chuàng)新興技術(shù)[7]。松質(zhì)骨為多孔的疏松結(jié)構(gòu)，具有不均一性和各向異性，檢測(cè)其骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的改變對(duì)于預(yù)測(cè)骨強(qiáng)度的改變具有重要意義：骨小梁骨密度反映骨量的多少，骨密度降低即骨量丟失；骨小梁數(shù)量減少、骨小梁分離度變大、骨小梁厚度變小都反映了骨量減少；結(jié)構(gòu)模型指數(shù)反映骨小梁板狀和桿狀梁比值大小，骨量減少時(shí)，板狀骨小梁減少，桿狀骨小梁增加，即結(jié)構(gòu)模型指數(shù)數(shù)值增加[8]。本研究中檢測(cè)指標(biāo)符合骨量減少趨勢(shì)，說明PM2.5暴露可致絕經(jīng)后脛骨、股骨、腰椎骨量減少。卵巢切除術(shù)可誘導(dǎo)高骨周轉(zhuǎn)率和快速骨量丟失的狀態(tài)，在8～9個(gè)月內(nèi)建立新的穩(wěn)定的骨量[9]。而我們建模一般選擇去勢(shì)后3～4個(gè)月檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)改變，從結(jié)果看脛骨的大部分指標(biāo)相對(duì)于對(duì)照組有明顯改變，股骨和腰椎則不明顯，提示我們，脛骨對(duì)于雌激素缺乏以及PM2.5暴露所引起的改變更為敏感。從micro-CT三維重建圖也可發(fā)現(xiàn)脛骨各組結(jié)構(gòu)改變尤為明顯，而股骨和腰椎各組其骨小梁結(jié)構(gòu)改變差異相對(duì)不明顯，但是骨小梁片狀結(jié)構(gòu)也是減少，桿狀結(jié)構(gòu)相對(duì)增多。

有學(xué)者[10]通過研究PM2.5影響老年雄性大鼠骨組織形態(tài)學(xué)的改變，其結(jié)果提示長(zhǎng)期暴露于PM2.5環(huán)境中，骨髓中的成骨細(xì)胞可能通過RANKL/OPG信號(hào)通路途徑，釋放RANKL與破骨細(xì)胞上的RANK受體結(jié)合，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生更多成熟的破骨細(xì)胞，使骨吸收增強(qiáng)，打破了骨吸收和骨形成的平衡過程，導(dǎo)致老年骨質(zhì)疏松的發(fā)生。眾所周知，絕經(jīng)后卵巢功能減退，雌激素水平低下，骨代謝相關(guān)指標(biāo)發(fā)生異常變化，即發(fā)生絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的概率增加。本研究證明處于PM2.5環(huán)境中，去勢(shì)的雌性SD大鼠骨小梁的骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生骨質(zhì)疏松樣改變，證明PM2.5暴露可加重絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。因此，研究PM2.5暴露對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的影響及其相關(guān)發(fā)病機(jī)制，通過阻斷和抑制相關(guān)信號(hào)途徑來達(dá)到治療或者減緩絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，對(duì)于提高患者生活質(zhì)量具有重要意義。

綜上，PM2.5暴露可引發(fā)或者加重絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本研究所檢測(cè)數(shù)量相對(duì)較少，日后還有待收集更多相關(guān)臨床樣本等做進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。