橙皮苷對去卵巢骨質疏松癥大鼠骨質流失和機制的影響

張曉文 馬應卓 朱佳麗 李娟芳 王濤

商洛學院健康管理學院護理系，陜西 商洛 726000

骨質疏松癥是目前常見的一種全身性代謝性骨病，其病理特點是骨量減少、骨微結構退化從而促使骨脆性增加易發生病理性骨折[1]。造成骨質疏松癥的原因主要有內分泌或營養因素、年齡和大量的慢性系統性疾病。它可以發生在任何年齡，其中絕經后的婦女是高發人群之一[2]。絕經后婦女骨質疏松主要是由于性腺功能下降，而性腺功能下降再加上年齡的增長，促進了絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMO)[3]。PMO引起的疼痛和骨骼變形均降低了女性患者的生活質量，同時給社會和家庭造成一定的經濟負擔。因此，PMO仍然是首要解決的問題。橙皮苷是一種生物類黃酮苷，主要存在于橘子、檸檬和其他柑橘類水果中[4]。橙皮苷具有多種生物活性，包括抗氧化[5]、抗炎和鎮痛活性[6]。研究表明橙皮苷可以防止雄性小鼠雄激素不足引起的骨質流失[7]。目前研究發現骨保護素(osteoprotegerin，OPG)/核因子kappa B配體的受體激活物(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)/RANK信號通路是調節骨代謝的重要途徑，主要是通過影響破骨細胞的分化成熟，從而影響骨代謝過程[8]。綜上所述，本文主要探究橙皮苷是否緩解去卵巢骨質疏松大鼠骨質流失并激活OPG/RANKL/RANK通路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

48只12周齡( 233.0 ± 28.3) g雌性 SD 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，在 25 ℃恒溫條件下 12 h晝夜交替的實驗室中適應性飼養 1 周后進行試驗。所有大鼠均自由飲水和飲食。將大鼠隨機分成6組(每組n = 8) ，分別為假手術組、去卵巢骨質疏松組、橙皮苷低劑量組、橙皮苷中劑量、橙皮苷高劑量組和雌激素組。對各組大鼠均進行腹腔注射麻醉 (3 %戊巴比妥鈉采用 1 mL/kg腹腔注射)，從雙側腰背部切口進入腹腔，雙側卵巢摘除建立去卵巢大鼠模型，假手術組僅切除雙側卵巢周圍等量脂肪[9]。橙皮苷低劑量組、橙皮苷中劑量、橙皮苷高劑量組按照25、50 mg/(kg·d)和100 mg/(kg·d)的劑量灌胃[10]；雌激素組按照 0.1 mg/(kg·d)的劑量灌胃 17-β雌二醇[11]；假手術組灌胃同等體積的蒸餾水。藥物治療10周后，麻醉后通過頸脫位對所有大鼠進行安樂死，收集股骨和血液樣本。

1.2 骨檢測指標

骨密度和骨微觀結構由微型計算機斷層掃描(Micro-CT)進行分析，取出右股骨保存于10 %福爾馬林液體中，隨后采用Micro-CT 平掃。使用Micro-CT提供的3 D Creator 軟件(Sky Scan)，對二維圖像生成三維渲染。使用軟件自動計算以下 3 D 參數，包括骨體積分數(bone volume fraction，BV/TV) 、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨密度(BONE MINERAL DENSity，BMD) 、骨小梁數量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)[12-13]。

1.3 總RNA提取、反轉錄和熒光定量

取骨組織 20 mg，液氮下充分研磨至粉末，使用TRIzol從骨組織提取總RNA，提取的總RNA首先去除基因組中的 DNA，然后進行反轉錄，以上步驟根據產品說明書進行操作。并按SYBR-Green PCR試劑盒說明擴增cDNA。使用2-ΔΔct方法計算mRNA的相對表達量。

1.4 染色

采集骨組織，通過固定、脫鈣、包埋、切片和HE染色，用蘇木精伊紅染色，并在顯微鏡下進行觀察。

1.5 蛋白免疫印跡(Western blot)

骨組織加入液氮研磨，并用裂解緩沖液裂解在4 ℃并以14 000 r/min離心15 min，形成濃縮蛋白質。然后對蛋白質濃度進行測量。取20 μg總蛋白在12 %十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，后轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將膜在37 ℃下用5%的牛血清白蛋白1 h封閉，然后與抗OPG、RANKL和RANK在4 ℃過夜。用TTBS洗滌后緩沖液(含Tween-20的Tris緩沖鹽水)，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(二抗)37 ℃反應1 h；洗膜后ECL曝光成像并應用quantity one軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.6 酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

根據制造商的說明，直接測量血清中人Ⅰ型膠原C端肽( C-terminal peptide collagen type Ⅰ，CTX-I)和血清骨鈣素(bone glaprotein，BGP)的表達量。用BIO-RAD酶標儀(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)測定光密度。使用ELISA試劑盒提供的細胞因子標準品建立測量的標準曲線。ELISA試劑盒購買于南京建成生物研究所。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 橙皮苷對去卵巢骨質疏松大鼠骨微觀結構變化的影響

如圖1結果表明，與假手術組相比，在去卵巢骨質疏松組中骨質疏松標志物BV/TV、BMD、Tb.Th和Tb.N水平降低，Tb.Sp水平升高，且差異具有統計學意義(P<0.01)。在橙皮苷或雌激素治療后，與去卵巢骨質疏松組相比，骨質疏松標志物BV/TV、BMD、Tb.Th和Tb.N水平升高，Tb.Sp水平降低，且差異具有統計學意義(P<0.05)。

注：與假手術組相比，**P< 0.01；與去卵巢骨質疏松組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。圖1 骨質疏松標記物的檢測Fig.1 Detection of osteoporosis markers

2.2 橙皮苷對去卵巢骨質疏松大鼠組織學影響

如圖2 結果所示，與假手術組相比，去卵巢骨質疏松組中骨小梁的數量明顯降低，骨小梁連接較為稀疏。在橙皮苷或雌激素治療后，與去卵巢骨質疏松組相比，大鼠骨小梁數量明顯增加，且骨小梁連接更為緊密。

圖2 骨組織病理學檢測 (400×)Fig.2 Detection of bone histopathology (400×)

2.3 橙皮苷對去卵巢骨質疏松大鼠骨吸收標志物CTX-Ⅰ的影響

如圖3結果表明，與假手術組相比，在去卵巢骨質疏松組中骨吸收標志物CTX-Ⅰ水平升高，且差異具有統計學意義(P<0.01)。在橙皮苷或雌激素治療后，與去卵巢骨質疏松組相比，骨吸收標志物CTX-Ⅰ水平降低，且差異具有統計學意義(P<0.05)。

注：與假手術組相比，**P< 0.01；與去卵巢骨質疏松組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。圖3 骨吸收標志物CTX-Ⅰ檢測Fig.3 Detection of bone resorption marker CTX-Ⅰ

2.4 橙皮苷對去卵巢骨質疏松大鼠骨形成標志物BGP的影響

如圖4結果表明，與假手術組相比，在去卵巢骨質疏松組中骨形成標志物BGP水平降低，且差異具有統計學意義(P<0.01)。在橙皮苷或雌激素治療后，與去卵巢骨質疏松組相比，骨形成標志物BGP水平升高，且差異具有統計學意義(P<0.05)。

注：與假手術組相比，**P< 0.01；與去卵巢骨質疏松組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。圖4 骨形成標志物BGP檢測Fig.4 Detection of bone formation marker BGP

2.5 橙皮苷對去卵巢骨質疏松大鼠OPG、RANKL和RANKmRNA表達的影響

如圖5結果表明，與假手術組相比，在去卵巢骨質疏松組中 OPG mRNA相對表達量降低，RANKL和RANK mRNA相對表達量升高，且差異具有統計學意義(P<0.01)。在橙皮苷或雌激素治療后，與去卵巢骨質疏松組相比，OPG mRNA相對表達量升高，RANKL和RANK mRNA相對表達量降低，且差異具有統計學意義(P<0.05)。

注：與假手術組相比，**P< 0.01；與去卵巢骨質疏松組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。圖5 OPG、RANKL和RANK mRNA相對表達量Fig.5 Relative mRNA expression levels of OPG, RANKL, and RANK

2.6 橙皮苷對去卵巢骨質疏松大鼠OPG、RANKL和RANK蛋白表達的影響

如圖6結果表明，與假手術組相比，在去卵巢骨質疏松組中 OPG 蛋白的表達量降低，RANKL和RANK蛋白的表達量升高，且差異具有統計學意義(P<0.01)。在橙皮苷或雌激素治療后，與去卵巢骨質疏松組相比，OPG蛋白的表達量升高，RANKL和RANK蛋白的表達量降低，且差異具有統計學意義(P<0.05)。

注：與假手術組相比，**P< 0.01；與去卵巢骨質疏松組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。圖6 OPG、RANKL和RANK 蛋白表達量Fig.6 Protein expression levels of OPG, RANKL, and RANK

3 討論

卵巢功能障礙造成的雌激素(estrogen，E)缺乏是引起絕經后骨質疏松癥發生的主要因素，激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)在近幾十年來得到了廣泛的應用[14-15]。然而子宮內膜長期在雌激素的刺激下就會引起增生，而導致子宮內膜癌。乳腺在雌激素的長期作用下，也會導致乳腺癌的發生。因此，對絕經后婦女骨質疏松患者來講首要任務尋找更有利的藥物是迫在眉睫的。

橙皮苷具有多效性作用，包括改善胰島素抵抗、改善脂質、抑制巨噬細胞泡沫細胞的形成、抗氧化作用和抗炎作用，從而減少動脈粥樣硬化[16]。研究[17]表明經橙皮苷治療顯著降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α , TNF-α )和NF-κB，促進血清骨代謝生化標志物的增加包括骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨鈣素(osteocalcin，OC)和降低血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)，顯著緩解預防糖尿病骨質疏松癥。研究[18]展示補充鈣并同時補充橙皮苷有效緩解絕經后婦女骨質疏松。研究表明橙皮苷治療組和雌二醇治療組中股骨Ca、P、Zn水平顯著高于去卵巢骨質疏松組。此外，橙皮苷降低了去卵巢骨質疏松小鼠股骨干骺端破骨細胞的數量；橙皮苷還能降低去卵巢小鼠肝臟脂肪的沉積[19]。在本研究中在橙皮苷治療后，與去卵巢骨質疏松組相比，骨質疏松標志物BV/TV、BMD、Tb.Th和Tb.N水平升高，Tb.Sp水平降低；大鼠骨小梁數量明顯增加，且骨小梁連接更為緊密；骨吸收標志物CTX-Ⅰ水平降低；骨形成標志物BGP水平升高。本研究表明橙皮苷能緩解去卵巢骨質疏松大鼠骨質流失。

目前研究發現OPG/RANKL/RANK信號通路是調節骨代謝的重要途徑，主要是通過影響破骨細胞的分化成熟，從而影響骨代謝過程[8]。OPG是阻礙骨吸收的關鍵調節因素，通過競爭性與 RANKL 相結合，封閉 RANKL 與 RANK 的連接通路，從而阻礙后續信號轉導途徑的發生，最終調節成熟破骨細胞的活性及凋亡速度，減弱骨吸收作用[11]。已經有研究[20]表明OPG/RANKL/RANK信號通路是雌激素受體激活通路的下游信號通路。本試驗中雌激素治療后，與去卵巢骨質疏松組相比，OPG mRNA相對表達量和蛋白的表達量升高，RANKL和RANKmRNA相對表達量和蛋白的表達量降低。在橙皮苷治療后，與去卵巢骨質疏松組相比，OPG mRNA相對表達量和蛋白的表達量升高，RANKL和RANK mRNA相對表達量和蛋白的表達量降低。這些結果表明橙皮苷通過調節OPG/RANKL/RANK信號通路緩解骨質疏松。

綜上所述，橙皮苷能緩解去卵巢骨質疏松大鼠骨質流失并調節OPG/RANKL/RANK信號通路，為今后治療絕經后骨質疏松患者提供了藥物選項。