二甲雙胍調控PI3K/Akt/mTOR通路減輕糖皮質激素誘導的成骨細胞凋亡

張豐姣 毛雨 何麗 宋利革 劉紅梅 許玲玉 孫玲 康志強 王永魁

鄭州大學附屬鄭州中心醫院內分泌科, 河南 鄭州 450000

骨質疏松癥是一種常見的慢性骨病，而糖皮質激素誘導的成骨細胞凋亡是大量或長期使用糖皮質激素導致骨質疏松的重要病理機制[1-2]。研究[3-5]顯示，骨質疏松癥的發生與多種信號通路的調控密切相關。其中，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路是細胞內重要的信號轉導途徑，在細胞增殖、凋亡和分化等過程中發揮著重要作用，與骨相關性疾病發生發展密切相關[6-7]。二甲雙胍(metformin，Met)是臨床常用降糖藥，具有抑制成骨細胞凋亡和改善糖皮質激素性骨質疏松的作用[8-9]，但其對糖皮質激素誘導的成骨細胞凋亡的影響及與PI3K/AKT/mTOR通路的關系并不明確。本研究以小鼠胚胎成骨細胞前體細胞株MC3T3-E1為研究對象，觀察Met調控PI3K/AKT/mTOR通路對長效類糖皮質激素地塞米松(dexamethasone，Dex)誘導MC3T3-E1細胞凋亡的影響，旨在為Met改善糖皮質激素所致骨質疏松提供新的參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

MC3T3-E1細胞株(貨號：GD-C0419676，美國ATCC)，Dex、Met和噻唑藍[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT](貨號：D4902、AS63254、M5655，美國Sigma)，Caspase-3活性測定試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒、總RNA提取試劑盒和通用反轉錄試劑盒(貨號：BC3830、CA1020、R1200、RP1105，北京索萊寶)，PI3K/AKT/mTOR通路活化劑胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)、抑制劑NVP-BEZ235和線粒體膜電位檢測試劑盒(貨號：P605、SC0330、C2006，上海碧云天)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、PI3K、AKT、磷酸化(phospho, p)-AKT、mTOR和p-mTOR抗體(貨號:ab181602、ab154598、ab18785、ab38449、ab32028、ab109268，英國Abcam)。凝膠成像儀、熒光定量PCR儀和流式細胞儀(型號：VersaDoc 3000、CFX96 Touch、ZE5，美國Bio-Rad)，二氧化碳細胞培養箱(型號：Herocell 180，美國Thermo)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養、分組與處理：將解凍復蘇后的MC3T3-E1細胞接種至含DMEM培養基(添加有10 %胎牛血清)的培養瓶中，在濕度飽和、37 ℃和5 %二氧化碳培養箱內常規培養；待細胞貼壁后，以0.25 %胰蛋白酶消化傳代。實驗分為：①對照組：正常培養；②Dex組：以含5 μmol/L Dex[5]培養基培養48 h；③Met組：以含5 μmol/L Dex和400 μmol/L Met[8]的培養基培養48 h；④Met+IGF-1組：以含5 μmol/L Dex、400 μmol/L Met和50 ng/mL IGF-1的培養基培養48 h；⑤Met+NVP-BEZ235組：以含5 μmol/L Dex、400 μmol/L Met和100 nmol/L NVP-BEZ235的培養基培養48 h。其中，每組設置3個重復。

1.2.2免疫印跡法檢測細胞中PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白表達：收集處理結束后的MC3T3-E1細胞，以磷酸緩沖液洗滌2次后，加入細胞裂解液抽提細胞總蛋白；將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混勻后置于沸水浴中煮沸5 min；將變性后的蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉膜；以5 %脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯2 h后，加入按照1∶1 000比例稀釋的PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR一抗工作液室溫孵育2 h；經按照1∶2 000比例稀釋的二抗工作液室溫孵育2 h后，以化學發光劑顯影曝光；以GAPDH為內參，采用凝膠成像分析系統掃描分析MC3T3-E1細胞中PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白表達水平。該過程重復3次。

1.2.3MTT法檢測細胞存活率：將生長狀態良好的第4代對數生長期的MC3T3-E1細胞接種至96孔板上，按照1.2.1中的分組處理細胞，另將只含有培養基不含細胞的孔作為空白組；處理結束后，每孔加入濃度為5 g/L MTT工作液20 μL孵育4 h；以二甲基亞砜震蕩反應15 min后，采用酶標儀檢測MC3T3-E1細胞在490 nm處光密度(optic density，OD)值，并按照公式[細胞存活率(%)=100%×[(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)]計算各組細胞存活率。該過程重復3次。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡率：收集處理結束后的MC3T3-E1細胞，以預冷的磷酸緩沖液洗滌細胞沉淀；采用600 μL 1×Binding Buffer調整細胞濃度；向含有105個細胞懸液中先后加入Annexin V-FITC和PI工作液各5 μL，混勻后避光下室溫孵育15 min，采用流式細胞儀在60 min內檢測MC3T3-E1細胞凋亡率。該過程重復3次。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測細胞中Bcl-2和Bax mRNA表達水平：先根據總RNA提取試劑盒說明書提取MC3T3-E1細胞總RNA后，再按照反轉錄試劑盒說明書將RNA進行反轉錄；以反轉錄獲得的cDNA為模板，根據上海吉瑪生物公司合成的PCR引物在20 μL反應體系下上熒光定量PCR儀進行擴增；以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法檢測MC3T3-E1細胞中Bcl-2和Bax mRNA表達水平。該過程重復3次。其中，PCR擴增參數如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共38個循環。擴增引物序列如下：Bcl-2上游：5’-GCCGGGAGAACAGGGTATGAT-3’，下游5’-GACGGTAGCGACGAGAGAAGT-3’；Bax上游：5’-CAGGATGCGTCCACCAAGAA-3’，下游5’-GTT GAAGTTGCCATCAGCAAA-CA-3’；GAPDH上游：5’-AATGTGTCCGTCGTGGATCTG-3’，下游5’-CAACCTGGTCCT-CAGTGTAGC-3’。

1.2.6Caspase-3活性測定試劑盒檢測細胞Caspase-3活性：收集處理結束后的各組MC3T3-E1細胞，采用磷酸緩沖液洗滌2次后，參照Caspase-3活性測定試劑盒說明書檢測MC3T3-E1細胞Caspase-3活性。該過程重復3次。

1.2.7JC-1探針檢測細胞線粒體膜電位：按照1.2.1中分組處理MC3T3-E1細胞后，參照JC-1探針線粒體膜電位檢測試劑盒說明書采用激光共聚焦顯微鏡檢測各組MC3T3-E1細胞線粒體膜電位變化，該過程重復3次。其中，在低水平的線粒體膜電位狀態下，JC-1單體不能形成聚合物而呈綠色熒光；在高水平的線粒體膜電位狀態下，JC-1單體可形成聚合物而成紅色熒光；故紅色熒光與綠色熒光百分比可反映出線粒體膜電位變化。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組細胞中PI3K/Akt/mTOR通路活化程度比較

與對照組比較，Dex組細胞中PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白PI3K、p-AKT和p-mTOR表達水平明顯降低(P<0.05)；與Dex組比較，Met組細胞中PI3K、p-AKT和p-mTOR表達水平明顯升高(P<0.05)；給予IGF-1后細胞中PI3K、p-AKT和p-mTOR表達水平明顯高于Met組，而給予NVP-BEZ235后細胞中PI3K、p-AKT和p-mTOR表達水平明顯低于Met組(P<0.05)。見圖1和表1。

表1 各組細胞中PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達水平比較Table 1 Comparison of the expression levels of PI3K/Akt/mTOR pathway related proteins in cells of each group

圖1 WB檢測細胞中PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達結果Fig.1 Expression of PI3K / Akt / mTOR pathway related proteins in cells by WB detection

2.2 各組細胞存活率比較

與對照組比較，Dex組細胞存活率明顯降低(P<0.05)；與Dex組比較，Met組細胞存活率明顯升高(P<0.05)；與Met組比較，IGF-1處理后細胞存活率明顯升高，而給予NVP-BEZ235作用后細胞存活率明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞存活率比較Table 2 Comparison of cell survival rate in each group (n=9,

2.3 各組細胞凋亡率比較

Dex組細胞凋亡率較對照組明顯升高(P<0.05)，而Met組細胞凋亡率明顯低于Dex組(P<0.05)；與Met組比較，給予IGF-1作用后細胞凋亡率明顯降低，而NVP-BEZ235作用后細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡Fig.2 Flow cytometry to detect cell apoptosis in each group

表3 各組細胞凋亡率比較Table 3 Comparison of the apoptosis rate in each group

2.4 各組細胞凋亡基因Bcl-2、Bax表達水平和Caspase-3活性比較

與對照組比較，Dex組細胞Bcl-2 mRNA表達水平明顯降低，而Bax mRNA表達水平和Caspase-3活性明顯升高(P<0.05)；與Dex組比較，Met組細胞中Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高，而Bax mRNA表達水平和Caspase-3活性明顯降低(P<0.05)；與Met組比較，給予IGF-1可使細胞中Bcl-2 mRNA表達升高而Bax mRNA表達、Caspase-3活性降低(P<0.05)，而給予NVP-BEZ235則使細胞中Bcl-2 mRNA表達降低而Bax mRNA表達、Caspase-3活性升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組細胞中Bcl-2、Bax mRNA表達水平和Caspase-3活性比較Table 4 Comparison of Bcl-2, Bax mRNA expression and caspase-3 activity in cells of each group

2.5 各組細胞線粒體膜電位比較

與對照組比較，Dex組細胞JC-1綠/紅熒光比例明顯升高(P<0.05)，說明Dex可誘導細胞線粒體膜電位降低；與Dex組比較，Met組細胞JC-1綠/紅熒光比例明顯降低(P<0.05)，說明Met可抑制Dex誘導引起的線粒體膜電位降低；與Met組比較，IGF-1作用后細胞JC-1綠/紅熒光比例進一步降低，而給予NVP-BEZ235作用后細胞JC-1綠/紅熒光比例明顯升高(P<0.05)，說明IGF-1可增強Met對線粒體膜電位的作用，而NVP-BEZ235則減弱Met對線粒體膜電位的作用。見表5。

表5 各組細胞線粒體膜電位比較Table 5 Comparison of the mitochondrial membrane potential in each group (n=9,

3 討論

糖皮質激素的不當使用會導致激素性骨壞死，而糖皮質激素誘導的成骨細胞凋亡是其致病的重要原因[10-12]；然而，糖皮質激素引起成骨細胞凋亡的分子機制并不明確。細胞凋亡是機體為維持內環境穩定細胞發生自主有序死亡的過程，主要包括內質網途徑、死亡受體途徑和線粒體途徑；其中，線粒體凋亡途徑最為重要，且受Bcl-2家族基因的嚴格調控；Bcl-2和Bax是Bcl-2家族成員，分別在線粒體內細胞色素C釋放過程中發揮著抑制和促進作用，在線粒體膜滲透性改變后細胞色素C進入細胞漿使凋亡執行因子Caspase-3活性增強，最終導致凋亡發生[13-14]。PI3K/AKT信號通路是細胞內重要的信號轉導途徑之一，可通過調控Bcl-2家族基因表達在線粒體凋亡途徑中發揮著重要作用[15]；mTOR是AKT下游通路的主要靶點，AKT磷酸化被激活可引起mTOR磷酸化，而活化的mTOR進入細胞核可通過調控Bcl-2、Bax等基因表達抑制線粒體凋亡途徑[16-17]。本研究以5 μmol/L Dex處理小鼠胚胎成骨細胞前體細胞MC3T3-E1后發現，MC3T3-E1細胞凋亡率、Bax基因表達水平和Caspase-3活性明顯升高，而細胞存活率、細胞中Bcl-2基因表達水平、線粒體膜電位和PI3K蛋白表達水平、AKT磷酸化水平、mTOR磷酸化水平均明顯降低。結果表明，Dex可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路活化引起MC3T3-E1細胞發生線粒體途徑凋亡。該結果與樊萍等[5]研究所得出的Dex抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路活化誘導成骨細胞凋亡的結果相吻合。提示，PI3K/AKT/mTOR信號通路介導的線粒體凋亡是糖皮質激素誘導細胞凋亡的重要機制。

Met是從葛根提取物中分離得到的胍類合成衍生物，具有降糖、抗腫瘤和免疫調節等廣泛的藥理活性[18-20]。本研究檢測發現，給予400 μmol/L Met作用后Dex誘導的MC3T3-E1細胞凋亡明顯受到抑制，細胞存活率、抑凋亡基因Bcl-2表達水平、線粒體膜電位均明顯升高，而促凋亡基因Bax表達水平和Caspase-3活性明顯降低。該結果與Zheng等[21]和甄東戶等[8]研究所得出的Met可抑制成骨細胞凋亡的結果相吻合，同時本研究還揭示了Met抑制的成骨細胞凋亡途徑是內源性線粒體凋亡途徑。Xu等[22]研究發現，Met改善胰島素抵抗的作用機制與激活PI3K/AKT信號通路有關；黃穎等[9]研究證實，Met可通過激活AKT信號通路改善糖皮質激素性骨質疏松。然而，Met是否通過調控PI3K/AKT信號通路發揮抑制成骨細胞凋亡的作用并不清楚。本研究進一步檢測發現，給予400 μmol/L Met作用后，Dex誘導的MC3T3-E1細胞中PI3K蛋白表達水平、AKT磷酸化水平、mTOR磷酸化水平均明顯升高。結果表明，Met可促進Dex誘導的MC3T3-E1細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路活化。本研究進一步給予IGF-1促進PI3K/AKT/mTOR信號通路活化后發現，Met對Dex誘導的MC3T3-E1細胞線粒體凋亡途徑的抑制效果明顯增強；而給予NVP-BEZ235抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路活化后發現，Met對Dex誘導的MC3T3-E1細胞線粒體凋亡途徑的抑制效果明顯減弱。結果表明，Met可通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制Dex誘導的MC3T3-E1細胞線粒體凋亡途徑。

綜上所述，Met通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制線粒體凋亡途徑減輕糖皮質激素Dex誘導的成骨細胞凋亡。然而，糖皮質激素誘導的成骨細胞凋亡機制十分復雜，Met是否還通過其他途徑發揮抑凋亡作用仍有待進一步深入探討。