HIF-1α在骨血管及骨代謝方面與骨質疏松癥相關性研究進展

王世浩 陳桐瑩 趙宇 劉樹華 萬雷

1．廣州中醫藥大學第三臨床醫學院，廣東 廣州 510405 2．廣州中醫藥大學第三附屬醫院，廣東 廣州 510375

骨質疏松癥的流行病學和發病機制研究顯示，除雌激素的缺乏外，衰老和相關的活性氧(reactive oxygen species , ROS)升高也是誘發骨質疏松癥的重要原因[1]，有研究[2]證明低氧是保護骨骼免受ROS介導損害的關鍵因素，而骨骼和骨髓腔處于天然的低氧狀態[3]。低氧作為一種常見的特征性微環境，與生命活動息息相關，同時也與眾多疾病的發生和發展有著千絲萬縷的聯系，這些疾病包括心血管疾病、阻塞性肺炎、腫瘤、骨代謝、炎癥等。近年來研究表明，維持骨穩態的成骨細胞和破骨細胞均屬于氧感應細胞[4]，低氧在參與調控骨重建和骨轉換的過程中發揮著重要作用[5]。缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是具有轉錄活性的核蛋白，在缺氧環境下穩定表達，具有相當廣泛的靶基因譜，主要由120 kD的HIF-1α和91～94 kD的HIF-1β兩個亞單位組成[6]，其中HIF-1α是HIF-1的活性亞基，對氧氣十分敏感[7]，是重要的缺氧調控因子，有研究[8-9]證明HIF-1α對原發性和繼發性骨質疏松的治療發揮著重要作用。故本文就HIF-1α在骨血管及骨代謝方面的作用對骨質疏松癥發生發展的影響及防治進行綜述。

1 HIF-1α的基本結構與生物特性

HIF-1α和HIF-1β構成HIF-1，其中HIF-1α的基因定位于人的14號染色體q21～24區，受缺氧信號調控；而HIF-1β的基因位于人的1號染色體q21區，又稱芳香烴受體核轉運子(ARNT)，起結構性作用[10]。HIF-1α由氧依賴降解結構域(oxygen-dependent degradation domain，ODDD)和兩個反式激活結構域(TAD-N和TAD-C)組成[11]，這些結構域都是缺氧誘導蛋白穩定、核定位和轉錄激活的調節域。

HIF-1α幾乎在所有類型的細胞中都有表達[12]，在常氧狀態下，HIF-1α上的脯氨酸殘基被脯氨酸羥化酶(PHD)羥基化[13]，這使得它可以被Von Hippel-Lindau蛋白(VHL)識別[14]，從而進行隨后的多泛素化和降解[15]。在低氧條件下，PHD的活性被抑制，阻止了HIF-1α的羥基化，導致HIF-1α在細胞質中積累并與HIF-1β結合形成二聚體，隨后被轉移到細胞核，在那里它與調節區的缺氧反應元件(HRE)結合[16]，導致其下游靶基因的激活，進而誘導對缺氧的反應，包括糖酵解、紅細胞生成、血管生成、細胞增殖和凋亡等過程。見圖1。

圖1 HIF-1α氧調控示意圖Fig.1 Schematic diagram of HIF-1α oxygen regulation

2 HIF-1α在骨血管及骨代謝方面對骨質疏松癥的作用

2.1 HIF-1α調節骨血管作用

骨骼是有著豐富血管的組織，在骨發育過程中，骨組織的血管化具有非常重要的作用。除了已被廣泛認知的骨膜表面血管外，Ritchlin等[17]首先在小鼠體內發現了一種跨皮層血管，這種血管在人體內同樣存在，說明在骨骼中有著比我們現有認知更加龐大而精密的血管網絡。

骨血管是骨質疏松癥研究中不可忽視的重要領域，豐富的骨血管是成骨細胞和破骨細胞生長分化的關鍵，血液不僅提供養分，同時也提供骨形成所必需的氧，當骨血管灌注不足時，骨組織就會形成低氧環境，從而誘導HIF-1α的穩定表達，而HIF-1α可通過調節OASIS蛋白、miRNA-675-5p等影響骨血管形成。

內質網(ER)應激傳感器OASIS是一種堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉錄因子，它是CREB/ATF家族的成員，在骨形成中發揮著重要作用[18]，Cui等[19]在實驗中發現，OASIS-HIF-1α復合物可能在骨骼發育和血管生成中起重要作用。OASIS與HIF-1α的相互作用影響HIF-1α靶基因的表達，血管內皮生長因子A(VEGFA)在OASIS缺陷型小鼠胚胎成纖維細胞中的表達水平顯著降低，同時血管生成受阻。Costa等[20]研究發現常氧狀態下，HIF-1α被泛素化可調高miRNA-675-5p的表達，從而促進了MSC標記(CD44、CD90和CD73)的下調，在低氧條件下HIF-1α的堆積會調低miRNA-675-5p的表達，進一步促進血管生成，以及恢復MSC的表型。HIF-1α可能通過miRNA-675-5P調節骨血管生成以及間充質干細胞的成骨的作用。

2.2 HIF-1α調節骨代謝

2.2.1HIF-1α調節成骨細胞作用：成骨細胞可分泌骨膠原和骨基質，是參與骨形成的主要功能細胞，低氧環境下，HIF-1α穩定表達，ALP、Runx2、骨鈣蛋白等成骨標志物顯著上調，表明成骨細胞增殖和分化作用增強。HIF-1α可通過對VEGF、IL-6、IL-8、Foxo1、VHL以及miRNA-497～195簇等的調控作用進而調節成骨細胞生成。

低氧環境下，骨組織內HIF-1α的表達增加，可上調VEGF，成骨細胞內含VEGF受體(VEGFR-1、VEGFR-2等)，VEGF 與其受體結合，可增強成骨細胞移動和分化功能[21]，即HIF-1α可上調VEGF來增強成骨細胞的分化和活性。除了VEGF外，Niu等[22]發現缺氧條件下，隨著HIF-1α的上調，IL-6和IL-8的表達也被上調，表明低氧條件下HIF-1α的過表達顯著增加了成骨細胞中IL-6和IL-8的水平，而IL-6和IL-8可以顯著促進人成骨細胞的增殖。

Foxo1是Foxo家族中最早和最具代表性的成員之一，它在許多生理和病理過程中起著重要作用，包括增殖、凋亡、吞噬作用、新陳代謝、炎癥、分化和氧化應激，Foxo1還是成骨細胞增殖和維持人體氧化還原平衡所需的轉錄因子。Xu[23]使用從兒童松質骨獲得的成骨細胞，在敲低HIF-1α后，明顯增加了細胞中的活性氧水平和凋亡，而HIF-1α的過表達刺激了細胞活力，也增加了Foxo1的轉錄和翻譯水平，沉默HIF-1α會明顯抑制細胞活力及Foxo1的表達水平。此外，沉默HIF-1α會降低成骨標志物(包括Runx2、ALP和骨鈣蛋白)的表達，而Foxo1(siRNA)明顯逆轉了HIF1α誘導的Runx2和ALP表達，但Foxo1(siRNA)對骨鈣素的影響不明顯。因此HIF-1α和Foxo1的相互作用參與了成骨細胞標志物的調控，并在成骨細胞的增殖和凋亡中起關鍵作用。

Shao等[24]通過條件性刪除von Hippel-Lindau(VHL)基因，HIF-1α在成熟成骨細胞中的過表達將顯著增加血管生成和成骨作用，成骨細胞缺乏VHL的小鼠具有高水平的HIF-1α，并增加了骨質量和密度。而HIF-1α條件性基因敲除小鼠的骨量和骨密度降低，研究還表明破骨細胞活性的必要調節劑骨保護素(OPG)可以被HIF-1α上調，進而下調破骨細胞的吸收活性，因此HIF-1α可能直接結合到OPG的上游位點并增強其表達，進而干擾成骨細胞和破骨細胞的骨耦合。

miRNA是一種非編碼小分子RNA，是重要的轉錄后調控因子，HIF-1α也可通過miRNA進而調節成骨細胞作用。Yang等[25]發現miRNA-497～195簇的過表達會上調HIF-1α水平，而miRNA-497～195簇在CD31hiEmcnhi內皮細胞中高表達，CD31和內粘蛋白(CD31hiEmcnhi)為血管生成與成骨的耦合的特定骨血管亞型，對骨形成有重要作用。在內皮細胞中敲低了miRNA-497～195的小鼠顯示出較少的CD31hiEmcnhi血管和較低的骨量，而miRNA-497～195在小鼠基因中的過表達則會逆轉該現象。

2.2.2HIF-1α調節破骨細胞作用：現有研究已證實在破骨細胞分化調節中腫瘤壞死因子受體家族的 NF-κB 受體活化因子配體(RANKL) 和骨保護素(OPG)起著重要的作用。RANKL與破骨細胞的核因子κB受體活化因子( receptor activator of NF-κB，RANK) 結合，激活細胞內信號傳導系統，刺激破骨細胞分化增殖，使骨吸收增加，骨量丟失；OPG可與RANKL結合，競爭性阻斷RANKL與RANK 的結合，從而抑制前體破骨細胞的分化和融合，抑制成熟破骨細胞的功能，誘導其凋亡[26]。

HIF-1α可通過OPG / RANK / RANKL、JAK2 / STAT3等多種信號通路直接或者間接產生對破骨細胞分化和吸收活性作用，但是其具體影響因素和機制還有待明確。破骨細胞作為防治骨質疏松癥的重要切入點，HIF-1α對破骨細胞作用的研究是具有重要意義的。

Shao等[24]發現HIF-1α可通過上調破骨細胞活性的必要調節劑骨保護素(OPG)，進而抑制破骨細胞活性。Shi等[27]研究同樣發現低氧環境下，HIF-1α的可增加hMSCs中OPG的表達增加，并降低RANKL表達，增加OPG / RANKL比，顯著促進成骨分化。而Kang等[28]發現HIF-1α除了上調OPG，還可以刺激白介素33(IL-33)表達增加，從而抑制破骨細胞生成。HIF-1α通過結合IL-33上的-1 504/-1 500 bp促進IL-33表達啟動子，IL-33作用于骨髓來源的單核細胞(BMM)，以減少其破骨細胞分化。但是Zhu等[29]的研究表明在缺氧條件下，上調的HIF-1α促進了RANKL的形成，從而促進破骨細胞的形成，RANKL的表達隨缺氧持續時間先升高后降低，該表達在24 h達到峰值。這與Knowles等[30]的觀點一致，其證實破骨細胞在低氧分化過程中需要復氧，如果持續暴露在缺氧下，由于細胞的廣泛死亡，會明顯抑制破骨細胞的形成和骨吸收功能。缺氧下HIF-1α的穩定表達可通過上調RANKL來促進破骨細胞的形成，其結論與Shi等[27]實驗結論相悖，可見HIF-1α調控破骨細胞的具體機制以及影響因素還有待進一步研究。

Zhu等[31]在另一個研究中發現HIF-1α通過激活MLO-Y4細胞中的JAK2 / STAT3通路來促進RANKL的表達，從而影響破骨細胞的生成。在缺氧條件下，JAK2抑制劑AG490抑制了p-JAK2、p-STAT3和RANKL表達，即AG490可能通過JAK2 / STAT3通路干擾了HIF-1α對RANKL的調節，從而影響破骨細胞的生成。Hulley等[32]研究發現HIF-1α siRNA僅適度影響破骨細胞的分化，通過抑制PHD誘導HIF-1α表達來減少破骨細胞生成，實際上是通過增強成熟破骨細胞的骨吸收來實現的，HIF-1α可能主要調節破骨細胞介導的骨吸收，對破骨細胞分化幾乎沒有影響。

2.2.3HIF-1α調節間充質干細胞作用：間充質干細胞(MSCs)是屬于中胚層的一類多能干細胞，主要存在于結締組織和器官間質中，以骨髓組織中含量最為豐富，具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內或體外環境下具有分化為肌細胞、肝細胞、成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、基質細胞等多種細胞的能力。

HIF-1α可通過調節miRNA-675-5P、VEGF、SDF-1的表達，直接或間接調控間充質干細胞的增殖、遷移以及向成骨分化作用，繼續深入研究HIF-1α對間充質干細胞調節作用對骨質疏松癥的防治有著不可忽略的價值。

Costa等[20]發現HIF-1α可通過miRNA-675-5P調節人間充質干細胞向血管成骨的作用，在低氧條件下HIF-1α的堆積會調低miRNA-675-5p的表達，進一步促進血管生成及MSCs的增殖。Yu等[33]研究了CoCl2誘導的細胞缺氧對MSCs成骨分化的影響，低氧增強了MSCs中HIF-1α的表達和STAT3的磷酸化，促進了成骨分化和VEGF表達，證明HIF-1α可通過STAT3信號促進間充質干細胞成骨分化和骨缺損愈合。Xu等[34]研究證明缺氧條件下HIF-1α的表達增加了MSC的趨化性遷移，在缺氧(1 %氧氣)條件下培養4～6 h后，遷移的MSCs數量明顯增加，同時，缺氧也增加了HIF-1α和基質細胞衍生因子(SDF-1)的表達, SDF-1及其受體CXCR4能夠調節細胞遷移；敲低MSCs中HIF-1α的表達，不僅消除了MSCs的遷移，而且也減少了SDF-1的表達。Lee等[35]發現HIF-1α促進78 kDa葡萄糖調節蛋白(GRP78)的表達，通過HIF-1α-GRP78-Akt信號通路促進了MSCs的增殖和遷移潛能。

3 HIF-1α在治療骨質疏松癥中的應用

目前HIF-1α在治療骨質疏松癥方面的應用多停留在細胞和動物模型實驗上，無論是單體還是中藥復方，均可通過作用于HIF-1α來對骨質疏松癥產生很好的治療效果。紅景天苷(SAL)是玫瑰紅景天的主要活性成分，具有多種藥理作用，Li等[36]在研究中發現SAL在體外和體內均顯示出抗缺氧作用，在低氧環境中，SAL通過刺激細胞活力，分化和礦化作用以及上調Osterix和Runx2表達來增強成骨作用，而這些作用歸因于HIF-1α信號通路的激活，SAL通過HIF-1α信號通路來保護MG63和ROB細胞免受CoCl2誘導的成骨細胞損傷和功能障礙。此外，研究還顯示SAL改善了OVX引起的骨質疏松癥，在OVX大鼠模型中，由VEGF表達增加引起的血管新生顯著修復了OVX大鼠的骨骼，防止骨質流失和骨小梁微結構改變。Guo等[37]發現，SAL可通過MAPK / ERK和PI3K / Akt信號通路影響HIF-1αmRNA表達，SAL可增強HIF-1α靶基因轉錄活性來上調VEGF，并通過促進成骨細胞的增殖，分化，礦化來增強成骨作用，SAL也增加了血管生成和加速小鼠模型的骨折愈合。Yuan等[38]研究表明補腎通絡湯(BSTLD)在OVX大鼠動物模型中，穩定了HIF-1α活性，隨后增加了VEGF表達，并增強了血管生成和調節RANKL / OPG信號傳導，保護卵巢切除引起的骨質疏松大鼠的小梁骨密度和小梁骨微結構。

4 展望

現階段對骨質疏松癥的認識已趨于成熟，其治療方法也不斷推陳出新，但是我們用于防治骨質疏松癥的方法還遠遠不夠。氧是骨細胞生長、發育及功能代謝的重要條件，氧感應細胞包括成骨細胞和破骨細胞的增殖分化以及骨血管在骨質疏松的形成、發展及防治中發揮著重要的作用。隨著細胞感知和適應氧氣的機制被揭開，HIF-1α可能成為骨質疏松癥極具潛力的新靶點。但是目前HIF-1α對骨血管生成、骨代謝的作用仍缺乏深入研究，明確其作用機制，尤其是對破骨細胞作用機制成為目前亟待解決的問題。