超高效液相色譜-高分辨質譜法測定肉類特征肽

王忠合，李曉婷，胡文梅，王軍

(韓山師范學院 食品工程與生物科技學院，廣東 潮州，521041)

近年來，隨著肉類價格差異不斷擴大，不法商家為了追求利益，借機用價格低廉的雞肉、馬肉、鴨肉、鼠肉等肉類品種偽制牛羊肉制品，該行為會影響飲食安全。這些與價格、原料和宗教等有關的食品摻假事件，不僅侵害了消費者的權益和食品公平交易，還嚴重威脅到了人們的身體健康和宗教信仰[1-3]。未標識的食品成分往往成為潛在的安全隱患，如過敏原及有毒成分會影響消費者的健康，錯誤的標簽也可能會違背特定群體的飲食習慣。對食品的種類、優劣、真偽的鑒別，尤其是對肉類的鑒別，均依賴于可靠的檢測方法，基于高分辨質譜的蛋白質組學方法檢測蛋白或多肽，具有靈敏度高、穩定性強等優點，可以實現多物種的同時測定，并且能夠對物種的特征蛋白或多肽進行明確鑒定，在鑒別肉類摻假等領域中具有廣泛的應用范圍。

采用質譜法鑒別肉種屬的關鍵技術就是特征肽段的篩選，但部分潛在的特征肽段在色譜洗脫中出峰時間太早或太晚甚至殘留在柱上，在質譜檢測中部分特征肽常常以相對低的豐度存在，而且食品樣品的基質復雜，高豐度的非目標冗余肽段及鹽等干擾物質的存在會嚴重影響質譜信號，加之基質的抑制作用，通過質譜檢測復雜的食品樣品中特定的肽段仍然是一個巨大的挑戰。采用高分辨質譜法篩選潛在的特征肽，三重四極桿質譜法定量測定同位素標記或未標記的肽為肉類摻假檢測提供了強有力的支撐，但是高分辨質譜法篩選出的潛在特征肽并不是都適合作為標記肽，如采用高分辨質譜法篩選到7種潛在的特征肽，在三重四極桿質譜中的多重反應監測法(multiple reaction monitoring，MRM)采集檢測中只有4種特征肽可檢測到[4]，采用MRM法檢測時需要保證特征肽可檢測出,信號豐度較好且專屬性強。

高分辨率質譜(highresolution mass spectrometry，HRMS)已在多個研究領域得到廣泛應用，在目標物篩查以及雜質鑒定中，HRMS的使用對定性篩查和結構確認產生了革命性影響。雖然三重四極桿質譜儀仍是定量分析的“黃金標準”，但是隨著HRMS技術的發展，其選擇性、動態范圍、線性、靈敏度等有了很大的提升，從而提高了HRMS在定量分析中的應用。在復雜基質干擾物存在的情況下，三重四極桿質譜儀法將面臨極大挑戰，而有著與之顯著不同特性的HRMS數據采集則具有出色的選擇性和靈敏度，從而成功實現定量分析。飛行時間質譜平臺功能強大的數據采集模式、靈活性和出色的采集速度為科學家們的研究提供極大幫助，特別是具有目標增益功能的飛行時間質譜的準多重反應監測模式(time-of-flight mass spectrometry-pseudo-multiple reaction monitoring，TOF-MRM)。在這種新的數據采集模式下，四極桿選擇母離子，并選擇性地在碰撞室中進行碎裂，TOF可選擇性的增加目標碎片的占空比，提高響應和選擇性。TOF-MRM模式可用于完整離子(母離子 > 母離子，未使用碰撞能)或碎片離子(母離子 > 碎片離子，使用碰撞能)的采集，HRMS平臺定量分析的選擇性和靈敏度可大幅提升，從而提高HRMS定量分析性能[5-8]。TOF-MRM的定量分析功能讓科學家們可以使用類似MRM的工作流程進行定量分析，拓展了HRMS平臺在定量分析中的應用，不僅可以進行常規的定性分析，更可直接應用于低檢出限(limit of detection，LOD)的定量分析。

本實驗選取4種肉類中的8條特征肽為目標物，研究超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜法(ultra-high pressure liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF MS)檢測參數、色譜分離條件、預處理等參數對特征肽檢測的影響，以期建立高效率、高靈敏的肉類制品中特征肽的檢測方法，為建立肉類摻假的檢測方法提供數據和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白酶(牛胰腺來源，10 000活力單位/mg蛋白)、正己烷(色譜級)等，美國Sigma-Aldrich公司；尿素、碳酸氫銨、硫脲、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、碘代乙酰胺、三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G250等試劑(純度≥99%)、固相萃取空柱(3 mL)，生工生物工程(上海)有限公司；質譜級乙腈、甲酸和甲醇，美國Fisher公司；氨水(質譜級)，美國Waters公司；合成肽，上海強耀生物科技有限公司；超純水(≥18 MΩ·cm)，實驗室自制；牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉，當地超市；肉丸制品，當地市場；亮氨酸腦啡肽(質譜級)、CAX陽離子交換小柱(3 mL/200mg)、親水/親油平衡(hydrophile-lipophile balance，HLB)固相萃取柱(3 mL/200mg)，美國沃特世有限公司；N-丙基乙二胺鍵合固相萃取填料、ENVI-18固相萃取填料，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

Waters I-Class Plus超高效液相色譜儀(由二元泵、柱溫箱、自動進樣器、脫氣機等組成)、Xevo G2-XS QTOF高分辨質譜儀[配電噴霧電離源(electrospray ionization，ESI)]，美國沃特世有限公司；JY3002電子天平，美國梅特勒-托利多儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，鞏義市予華儀器有限責任公司；ZX4漩渦振蕩器，意大利VELP公司；JSP-200型高速多功能粉碎機，浙江省永康市金穗機械制造廠；Milli Q超純水機，美國密理博有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白提取

先將原料肉攪碎，再稱取0.5 g肉樣于10 mL離心管中，加入4 mL提取緩沖液(0.3 mol/L KCl、0.3 mol/L KH2PO4、pH 6.5，或6 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、50 mmol/L Tris-HCl)，用旋渦混合器混勻5 min，超聲處理30 min，在室溫下于10 730×g離心40 min，收集上清液，轉移到10 mL離心管中并渦旋1 min。隨后，將提取物在室溫下1 315×g離心3 min，以消除先前步驟中可能產生的泡沫。該上清液即為牛肉蛋白原樣液，采用考馬斯亮藍染色法測定蛋白含量，于4 ℃下保存。

1.3.2 蛋白酶解

取0.1 mL提取液用0.4 mL緩沖液混合稀釋加入到試管中，然后加入2.4 mL濃度為30 mmol/L 碳酸氫銨混合均勻，將提取物在90 ℃下加熱30 min，以使溶液中的蛋白質變性，冷卻至室溫，隨后添加50 mmol/L 二硫蘇糖醇使其最終濃度為5 mmol/L。添加150 mmol/L碘代乙酰胺使蛋白質烷基化，最終濃度為15 mmol/L，暗處反應30 min。隨后，添加1.5 mL濃度為1 mg/mL的胰蛋白酶溶液(用30 mmol/L 碳酸氫銨配制)，立即將酶解液渦旋1 min，置于37 ℃酶解12 h。

1.3.3 肽段純化

將酶解液過固相萃取柱進行脫鹽處理，先用3 mL甲醇洗滌和活化萃取柱，然后用3 mL體積分數1%的甲酸平衡。將酶解液過柱，并用0.5 mL體積分數為1%的甲酸沖洗柱子，將洗滌液裝入小柱，以定量轉移樣品。然后用1 mL體積分數為1%的甲酸洗滌小柱。最后，將肽用3 mL的乙腈-水混合物(體積比1∶1，含體積分數0.1%甲酸)洗脫到離心管中，分2次重復洗脫，第1次加2 mL混合洗脫液，第2次加1 mL混合洗脫液，在第1次洗脫液后，將小柱浸泡10 min以使肽完全洗脫[9]。隨后，將全部洗脫液在氮氣流中吹干，分析前將純化物用0.5 mL的乙腈-水混合物(體積比3∶97，含0.1%甲酸)復溶，渦旋30 s，過0.22 μm濾膜，上機檢測。

1.3.4 色譜-質譜條件

色譜條件：色譜柱Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱溫40 ℃，進樣室溫度10 ℃，流速0.2 mL/min；流動相A為0.1%(體積分數)甲酸-水溶液，流動相B為0.1%(體積分數)甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫時間分別探討15、20、30、35 min，具體洗脫程序如表1所示。

表1 液相洗脫程序Table 1 Gradient elution program employed for the separation of peptides

質譜條件：正離子(ESI+)靈敏度模式，毛細管電壓3.0 kV，離子源溫度130 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔氣流速60 L/h，脫溶劑氣流速800 L/h，掃描時間0.2 s，數據格式為棒狀圖，一級母離子掃描范圍m/z為400～1 500，二級碎片離子掃描范圍m/z為50～2 000，前1 min和后6 min的流動相進廢液不采集信號；MS/MS優化采集方法：根據各肽段的理論值(表2)，母離子m/z分別固定設為576.32(pep1)、554.79(pep2)、603.34(pep3)、672.36(pep4)、573.31(pep5)、525.28(pep6)、534.30(pep7)、563.80(pep8)，不加碰撞能；二級碎片離子碰撞能CE值分別設10、15、20、25、30、35、40 eV。TOF-MRM定量采集方法：母離子質量數分別設為384.55(pep1)、554.79(pep2)、603.34(pep3)、672.36(pep4)、573.31(pep5)、525.28(pep6)、534.30(pep7)、376.20(pep8)，并選擇目標增益功能；各肽段碎片定量離子和碰撞能采用優化后的值。采用質量鎖定技術測定準確質量數，以200 pg/μL的亮氨酸腦啡肽溶液為鎖定質量溶液，流速為5 μL/min，電壓為0.53 kV，每隔30 s采集1次，在正離子模式下產生m/z556.277 1的離子[10]。

表2 TOF-MRM測定肉種屬用的各特征肽段的信息Table 2 Details of marker peptides determined by TOF-MRM in meat species determination

續表2

1.3.5 基質效應(matrix effect，ME)評價

分別準確稱取牛肉丸樣品9份，加緩沖液(0.3 mol/L KCl、0.3 mol/L KH2PO4、pH 6.5)提取，離心后取上清液過HLB柱凈化，收集流出液過0.22 μm微孔濾膜，作為樣品溶液。取凈化后的樣品溶液1.6 mL，加入0.4 mL的混合標準肽工作溶液至終質量濃度為2.88～1 250 μg/L，注入UPLC-QTOF MS測定，分別作基質匹配和溶劑外標曲線。ME以基質匹配標準曲線的斜率與溶劑曲線斜率的比值評定[11]，比值>1，表現為基質增強效應；比值<1則為基質抑制效應，用ME表示，ME計算如公式(1)所示：

(1)

1.4 數據處理

采用Waters公司的MassLynx 4.1軟件，通過提取MS/MS采集方法中各通道母離子及碎片離子的質譜圖，調節碰撞能量以獲得各衍生產物的信號強度高、穩定性好的離子碎片，并篩選出定量離子對。TOF-MRM定量采集圖選用ApexTrack的積分方法，適當調整積分參數的方式完成色譜積分，根據質譜圖中碎片離子峰的強度進行定量分析[10]。實驗結果以平均值±標準偏差表示，采用SPSS 17.0進行統計分析，以P<0.05為檢驗標準。

2 結果與分析

2.1 質譜參數的選擇

分別取合成肽的母液1.0 mL，分別加入3%乙腈水(含0.1%甲酸)復溶液稀釋成濃度為0.1 mg/L的肽標準溶液，將各肽標準溶液注入進樣器中，色譜分離后在正離子模式下進行MS/MS掃描，得到各肽的母離子及碎片離子峰的掃描圖，如圖1所示。毛細管電壓、錐孔電壓和碰撞能量是影響質譜測定結果的重要因素，錐孔電壓直接影響各組分的靈敏度[10]，過高的錐孔電壓會導致分子離子在離子源內發生碰撞解離，從而影響母離子的豐度，進而影響檢出限和靈敏度。錐孔電壓40 V且不加碰撞能量下采集的質譜圖中各肽母離子帶2個或3個電荷的信號強度高、穩定性好，施加碰撞能量后采集的二級質譜圖中各肽段的碎片離子主要是y離子，且母離子帶3個電荷的肽段所得碎片離子中伴有帶2個電荷的碎片離子形成，如表3和圖1-a所示。各肽段施加不同碰撞能量對碎片離子質譜圖的影響如圖1-b所示，隨著施加碰撞能量的增大，各肽段的母離子信號強度降低、碎片離子信號強度增加，如前所述主要以y離子形式存在，分別選擇576.322+(pep1)、554.792+(pep2)、603.342+(pep3)、672.362+(pep4)、573.312+(pep5)、525.282+(pep6)、534.302+(pep7)、563.802+(pep8)作為各肽段定量分析的母離子，使用TOF-MRM采集模式和目標增益采集數據，該模式下四極桿中選擇母離子，儀器的目標增益功能可增加目標離子的靈敏度，從而大大增強了定量分析的靈敏度和選擇性。優化后的定量分析的碎片離子和碰撞能如表3所示。

表3 八條特征肽段測定結果Table 3 Measured results of eight marker peptides

2.2 色譜條件的優化

質量濃度為0.1 mg/L的肽混合標準溶液1.0 mL，分別采用1.3.4中的3種洗脫梯度進行色譜分析，TOF-MRM質譜模式采集，檢測結果如圖2所示。

由圖2可以看出，不同梯度洗脫分離的8種特征肽的分離效果差異較大，大部分肽的色譜圖的峰形較好，各特征肽的信號強度較強，信號穩定，30 min洗脫程序的分離效果更好，但特征肽1和特征肽6的分離效果較差，分離度僅為0.99，而特征肽7和特征肽3的出峰時間較晚，分離效果非常好，因而可以在此基礎上進行優化，壓縮前5 min和最后10 min程序洗脫的時間，拉長中間程序洗脫的時間，優化后的洗脫程序如表4所示。

表4 優化后的8種特征肽液相色譜分離洗脫程序Table 4 Optimized elution procedure of 8 marker peptides by liquid chromatography separation

圖2 液相色譜梯度洗脫程序的優化Fig.2 Optimization of gradient elution procedure in liquid chromatography

a-碎片離子形成；b-碰撞能優化圖1 肽中碎片離子形成和碰撞能優化Fig.1 Fragment ion formation in marker peptides and optimization of collision energy in MS/MS acquisition modes注：圖1-b中2至8通道分別施加10、15、20、25、30、35、40 eV碰撞能

2.3 質譜參數的優化

由圖3可以看出，特征肽pep8和pep1的信號強度較弱，這主要是因為在MS/MS模式下設定帶2價電荷的母離子，而TOF-MRM模式下pep8和pep1的母離子有帶2價電荷的母離子和帶3價電荷的母離子，二者共存，且帶3價電荷的母離子的信號強度更大，因而特征肽pep8和pep1的母離子需要選帶3價電荷的離子作為目標母離子，信號強度分別增強3.8和6.6倍，優化后的各特征肽TOF-MS/MS圖譜如圖4所示，分離效果好、信號穩定。

圖4 優化后的肽測定圖譜Fig.4 The optimized peptide chromatogram

續表3

a-特征肽測定的色譜-質譜圖；b-特征肽pep1的母離子質譜圖；c-特征肽pep8的母離子質譜圖圖3 母離子對TOF-MRM定量分析的影響Fig.3 Effect of parent ions on TOF-MRM quantitative analysis

2.4 方法學考察

移取適量的特征肽混合標準工作溶液，按照1.3的方法處理，配制系列濃度的特征肽混合標準溶液測定，各特征肽的檢測結果如表5所示。由于所添加的2種特征肽為樣品中的內源性物質，因此標準曲線是在扣除基質本底后繪制而成，其余特征肽可直接繪制標準曲線。LOD和定量限(limit of quantitation，LOQ)是通過在空白樣品中添加目標組分的方法分別依據其特征離子色譜峰的信噪比(S/N)大于3和10而測定的[12]。8種目標特征肽的線性相關系數均大于0.98，樣品中各測定的目標特征肽均在線性范圍內。一般情況下，ME在85%～115%時不存在明顯的基質效應。據此判斷，本檢測方法對特征肽1、3、4有較強的抑制效應，而對其他特征肽的基質效應不顯著(表5)。

表5 特征肽測定的回歸方程、檢出限、定量限及METable 5 Regression equation, detection limit，quantitation linit and ME for determination of marker peptides

2.5 方法的回收率、精密度及其穩定性

移取適量的特征肽混合標準工作溶液，加入到肉樣品中，配制低、中、高3個質量濃度水平(1、10、50倍定量限)的添加試驗，按照1.3.1的方法處理，回收率和精密度實驗測定結果如表6所示。各特征肽目標物的加標回收率為61%～102%，相對標準偏差(relative standard deviations，RSD)<10%，可用于肉及肉制品樣品中特征肽含量的測定。

表6 樣品中特征肽測定的添加回收率及RSDTable 6 Recoveries and RSD of marker peptides spiked in meat samples

2.6 實際樣品的測定

為了驗證所建立分析方法的適用性，對市場上隨機抽取的7種價位的35份牛肉丸樣品進行檢測，結果如表7所示。結果顯示，本次抽樣篩查的牛肉丸樣品中共檢測出5條特征肽，其種屬來源分別為牛肉2條、豬肉1條、雞肉2條，這表明牛肉丸樣品中不同程度地混有其他種類的肉，其混入量不等，與牛肉丸的價格高低無關。鴨肉中的2條特征肽沒檢出，可能是牛肉丸樣品中未混入鴨肉，而另1條豬肉特征肽未測到，可能是與該特征肽在豬不同部位的肉中的分布有關，有待深入探討，后續論文另有研究報道。并且采用四極桿串聯軌道阱中的信息依賴性、信息非依賴性、平行反應模式等采集模式及PCR方法進行對比，測定結果與本方法吻合，進一步證明了所建方法的可靠性。

表7 牛肉丸樣品中特征肽測定的結果 單位：mg/g

3 結論

8條目標特征肽的母離子帶2個或3個電荷的信號強度高、穩定性好，施加碰撞能量后采集的二級質譜圖中各肽段的碎片離子主要是y離子，且母離子帶3個電荷的肽段所得碎片離子也有帶2個電荷的碎片離子，使用TOF-MRM采集模式和目標增益采集數據可增加目標離子的檢測靈敏度，從而大大增強了定量分析的靈敏度和選擇性。優化后梯度對8條特征肽的洗脫分離效果非常好，特征肽8和特征肽1的母離子選帶3價電荷的離子，優化后的質譜信號穩定、檢出限低，相關系數在0.99左右，各特征肽目標物的加標回收率為61%～102%，RSD<10%，可用于肉及肉制品中特征肽含量的測定及肉類摻假鑒別。市場上7種價位的牛肉丸中共檢出5條特征肽，其中2條來源于雞肉、1條來源于豬肉，這表明牛肉丸樣品中不同程度地混有雞肉或豬肉，且其混入量不等、與價格高低無關，這進一步證明了所建方法的可靠性與可應用性。