利用擴增子測序技術分析不同紅茶菌中微生物多樣性

黎琪，王晴，檀馨悅，李曉敏，張曉琳*

1(中糧營養健康研究院有限公司，北京，102209)2(營養健康與食品安全北京市重點實驗室，北京，102209)3(老年營養食品研究北京市工程實驗室，北京，102209)

紅茶菌是一種由多種細菌和酵母菌組成的共生菌群發酵糖茶水而成的傳統發酵飲品[1]。紅茶菌酸甜可口，被報道具有保護肝臟、抗氧化、抗菌和抗癌等諸多健康功效[2-3]，最新研究發現紅茶菌還能通過激活調節性T細胞和Th2細胞改善實驗性自身免疫性腦脊髓炎[4]。據報道，紅茶菌最早出現在我國秦朝，后逐漸傳入日本、德國等地，近年來，全球多家飲料巨頭已涉足紅茶菌飲品市場，發展前景十分廣闊。紅茶菌的生產起初僅以紅茶或綠茶為底料，后來陸續有烏龍茶、黑茶和茉莉花茶等茶葉作為底料的研究，其所用糖類一般以蔗糖為主，眾多學者在紅茶菌發酵生產中加入蔬果汁或中草藥以豐富紅茶菌飲品的風味和健康功效[5]。目前我國市場上出現的紅茶菌飲品，風味與傳統紅茶菌相比仍有一定差距，這主要因為傳統紅茶菌復雜的菌群結構[6]，促進了其豐富獨特風味的形成[7-8]，而工業化生產為了保證產品品質穩定，通常選擇一種或者幾種常見食品用于菌種復配發酵，難以產生傳統紅茶菌的特殊風味。因此，研究紅茶菌中微生物多樣性，探究菌群與風味之間的關聯性，對于紅茶菌產品的開發和工業化生產至關重要。

目前對于紅茶菌中微生物的研究主要分為培養依賴分析法和非培養依賴分析法[9]。擴增子測序技術作為非培養依賴分析法的一種，利用保守區設計通用引物進行PCR擴增，然后對高變區進行測序[10-11]，通過相關分析獲得樣品中微生物的物種組成、物種豐度、系統進化和群落比較等諸多信息[12]。本研究采用擴增子測序技術對11個紅茶菌樣品中微生物多樣性進行分析，結合感官評價結果，以期挖掘紅茶菌中風味相關的優勢菌群，為開發適用于標準化、工業化生產紅茶菌飲品的發酵菌劑提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶菌樣品包括10個國內樣品和1個國外樣品，具體信息見表1。

表1 紅茶菌樣品基本信息Table 1 Basic information of kombucha samples

茶葉和白砂糖均購自電商；DNA抽提試劑盒，美國MP Biomedicals公司；2%瓊脂糖凝膠，西班牙Biowest公司；FastPfu DNA Polymerase，北京全式金生物技術有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，美國AXYGEN公司；TruSeqTMDNA樣本制備試劑盒，美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

ME3002E型分析天平、S210-K型pH計，美國梅特勒-托利多公司；LRH-250F型生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司；NanoDrop2000型分光光度計，美國Thermo公司；ABI GeneAmp?9700型PCR儀，美國ABI公司；MISEQ測序儀，美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅茶菌飲品的制備和感官評價方法

將11個紅茶菌樣品分別以10%接種量接種至糖茶水(0.5%茶葉、8%白砂糖)中，于30 ℃恒溫培養箱中培養至發酵液pH<3.2后，發酵液經過濾和巴氏滅菌處理制得紅茶菌飲品。飲品經冷藏后分裝至一次性透明塑料小品評杯中，隱去樣品代表性信息，由15位具有食品專業背景的人員(年齡23～46歲、男∶女=8∶7),在食品實驗室中按表2對紅茶菌飲品進行感官評分，不同樣品之間使用純凈水漱口以減少誤差。

表2 紅茶菌飲品感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria for kombucha beverages

1.3.2 DNA提取、PCR擴增和測序

按照DNA抽提試劑盒說明書進行總DNA提取，檢測DNA濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。細菌用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTC-TAAT-3′)引物進行PCR擴增，真菌用SSU0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′)和SSU1196R(5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′)引物進行PCR擴增；引物擴增程序為：95 ℃ 預變性3 min，35個循環(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，最后72 ℃延伸10 min；擴增體系為20 μL，其中4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs， 0.8 μL 引物(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進行純化，根據Illumina MiSeq 平臺標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序。

1.3.3 數據處理

首先對原始測序數據進行過濾處理得到有效數據，然后基于有效數據進行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類，選取OTU的代表性序列，與核糖體RNA數據庫(Greengenes Database 13.8版本)進行比對獲得物種注釋信息。基于數據均一化后的OTU物種豐度譜，利用qiime2 diversity軟件評估樣品的Alpha多樣性。

2 結果與分析

2.1 紅茶菌飲品感官評價結果

統計色澤、氣味、滋味和整體喜好度評分平均分，除氣味評分最高樣品為GD9外，其他項目評分最高均為樣品AH7，評分最低均為樣品SY6(表3)。按對應權重計算最終得分，并根據得分將樣品分為好(100～85分)、中(84～70分)和差(69分及以下)3組，用于后文基于感官評價的微生物聚類分析。

表3 紅茶菌飲品感官評價結果Table 3 Sensory evaluation results of kombucha beverages

2.2 紅茶菌中DNA提取與定量

提取新鮮紅茶菌菌膜及菌液混合物的DNA，測定其質量與純度，樣品中DNA的OD260nm/OD280nm值為1.72～2.41，OD260nm/OD230nm值為0.01～0.05，其質量濃度為0.10～7.50 ng/μL(表4)。OD260nm/OD280nm值>1.8表示DNA純度高，OD260nm/OD230nm值<2.0表明樣品可能受到鹽類和有機物等污染。經PCR擴增，產物目的條帶均大小正確，濃度合適，可進行后續試驗。

表4 紅茶菌樣品DNA質量濃度分析Table 4 DNA concentration analysis of kombucha samples

2.3 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數用于研究環境樣品中微生物的多樣性，包括Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和覆蓋度。Shannon指數值越高，Simpson指數值越低，表示微生物多樣性越豐富。Chao1指數主要用于衡量樣本中的微生物種類豐富度，其數值越大，表示微生物種類越多。覆蓋度是指各樣本中低豐度OTU的覆蓋情況，其數值越高，則樣本中序列被測出的概率越高[13-14]。

如表5所示,就細菌而言，樣品GD9和SD10的Shannon指數值較高、Simpson指數值較低，表明這2個樣品細菌OTU多樣性水平較高。Chao1指數值較高的樣品為BJ4、SY6、AH8、GD9和SD10，表明這些樣品細菌OTU種類較多，樣品AJ2的Chao1指數值最低，表明其細菌OTU種類較少。就真菌而言，樣品BJ3、BJ4 和AH7的Shannon指數值較高、Simpson指數值較低，表明這3個樣品真菌OTU多樣性水平較高。Chao1指數值較高的樣品為XJ5、BJ4、SY6、AH7和SX11，表明這些樣品真菌OTU種類較多，樣品SD1的Chao1指數值最低，表明其真菌OTU種類較少。表5中覆蓋度數值均為1.00，說明測序已經較大程度覆蓋低豐度OTU，表明本次測序結果可以代表樣本中細菌和真菌的真實情況。

表5 樣品細菌和真菌多樣性指數Table 5 Microbial α-diversity index of kombucha samples

2.4 紅茶菌中細菌群落結構分析

2.4.1 物種組成

在門水平上，樣品中共出現9個門，包括8個已知門：變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、綠菌門(Chlorobi)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門(Actinobacteria)，1個未鑒定。所有樣品中變形菌門均占優勢，相對豐度占98.92%以上，其中樣品AJ2和SX11達100%。厚壁菌門存在于9個樣品中，擬桿菌門存在于5個樣品中，兩者相對豐度占比最高的均為樣品BJ4，分別為0.25%和0.76%。表明樣品BJ4較其他樣品在門水平上的細菌種類更為豐富。

在屬水平上，樣品共出現74個屬，其中相對豐度排名前20的屬如圖1所示。所有樣品的優勢菌屬一致，均為葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter)，在樣品SY6中相對豐度最高為99.56%。雖然各樣品優勢菌屬一致，但相對豐度第2的菌屬表現不同，除樣品SY6外，僅樣品SD10相對豐度第2的菌屬(10.5%)為葡糖桿菌屬(Gluconobacter)，其余樣品均為假單胞菌屬(Pseudomonas)，并且占比差異較大，在樣品GD9中占比最高(13.91%)，在樣品AJ2中占比最低(2.62%)。在樣品SD10中相對豐度第3(1.24%)的菌屬為假單胞菌屬，在樣品AH7、AH8和SX11中相對豐度第3的菌屬均為葡糖桿菌屬，在樣品SD1、XJ5和GD9中相對豐度第3的菌屬都是羅爾斯通菌屬(Ralstonia)。另外，紅球菌屬(Rhodococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、Sulfurimonas、Odoribacter和Herminiimonas在部分樣品中少量出現。

a-門水平；b-屬水平圖1 不同紅茶菌樣品中細菌在門水平和屬水平上的相對豐度Fig.1 Relative frequency of bacteria in different kombucha samples at phylum and genus levels

2.4.2 基于感官評價的物種分析

對3組不同感官評價樣品中細菌組成進行分析(圖2)，細菌種類139種，共有物種12個，包括葡糖醋桿菌屬的3個種(總序列數和為377 693)、假單胞菌屬的3個種(總序列數和為22 740)、葡糖桿菌屬的1個種(序列數為6 338)、羅爾斯通菌屬的1個種(序列數為618)、unspecifiedSulfurimonas(序列數223)、unspecifiedHerminiimonas(序列數為140)、unspecifiedOdoribacter(序列數為19)和普雷沃菌屬(Prevotella)的1個種(序列數為16)。感官評價為好的組特有細菌種類有41個，其中葡糖醋桿菌屬相對豐度最高(89.75%)，假單胞菌屬次之(5.85%)；評價為中的組特有細菌種類有9個，其中葡糖桿菌屬相對豐度最高(71.76%)；評價為差的組特有細菌種類有62個，其中普雷沃菌屬相對豐度最高(22.78%)。

圖2 不同感官評價分組中共有和特有細菌物種韋恩圖Fig.2 Venn diagram of common and endemic bacterial species based on sensory evaluation

3組不同感官評價分組(圖3)中unspecifiedGluconacetobacter豐度均最高，且差別不大，其次為居間葡糖醋桿菌(Gluconacetobacterintermedius)、假單胞菌屬的2個種、unspecifiedRalstonia和unspecifiedGluconobacter，表明unspecifiedGluconacetobacter是構成各分組紅茶菌細菌的絕對優勢菌種。MARSH等[15]研究發現在大多數紅茶菌樣品中葡糖醋桿菌屬占比達85%以上，與本文研究結果一致。葡糖醋桿菌屬是產生有機酸的重要菌種，能促進醇類和酯類等芳香物質的形成[16-17]。結合紅茶菌樣品中細菌特有物種分析，表明葡糖醋桿菌屬的某些種可促進紅茶菌獨特風味物質的形成。王潔琛等[18]從紅茶菌樣品中分離的優勢細菌為居間駒形桿菌(Komagataeibacterintermedius)，MUZAFFER等[19]利用宏基因組結合擴增子測序方法測得紅茶菌發酵過程中不同時間點的優勢細菌也為駒形桿菌屬。根據圖3結果表明居間葡糖醋桿菌(該菌中文名因分類原因更為居間駒形桿菌，本文便于統計分析暫用此名稱)相對含量與紅茶菌風味不呈相關性，但是紅茶菌中較為重要的菌種。此外，假單胞菌屬在一定范圍內相對含量越高越好，unspecifiedRalstonia相當含量對紅茶菌風味影響不大，unspecifiedGluconobacter相對含量適度增高可能利于好的風味物質形成，硫桿菌、紅球菌、瘤胃球菌、擬桿菌、普氏菌和Enterobacteriaceae的出現會使紅茶菌感官品質變差。

圖3 不同感官評價分組細菌種類熱圖Fig.3 Heatmaps of bacteria based on sensory evaluation at species levels

2.5 紅茶菌中真菌群落結構分析

2.5.1 物種組成

在門水平上，樣品中共出現4個門，包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、Mucoromycota和線蟲門(Nematoda)(圖4)。所有樣品中優勢菌門為子囊菌門，均占99.45%以上，其中樣品AH8、AJ2、GD9、SD1和SD10達100%，較優勢的菌門為擔子菌門，存在于5個樣品中，其中樣品SY6相對豐度最高為0.50%。表明樣品SY6較其他樣品在門水平上的真菌物種更為豐富。僅存在樣品SX11中的線蟲門相對豐度極低，不足0.01%。單齒類線蟲(Nematoda Mononchida)為捕食性線蟲，常用于植物生物防治[20]，因紅茶菌樣品中含有茶葉成分，推測可能由茶葉原料帶入。

在屬水平上，樣品共出現38個屬，其中相對豐度排名前20的屬如圖4所示。各樣品優勢菌屬均不一致，其中樣品AH7、AH8、AJ2、BJ3和XJ5的優勢菌屬為酒香酵母屬(Brettanomyces)，相對豐度為40%～75%；樣品SD1、SD10、SX11和SY6的優勢菌屬為接合酵母屬(Zygosaccharomyces)，相對豐度均達95%以上；樣品BJ4和GD9的優勢菌屬為假絲酵母屬(Candidas)，相對豐度分別為40.54%和97.40%。各樣品相對豐度第2的菌屬也表現不同，包括上述3種菌屬以及酵母目(Saccharomycetales)，其中酵母目作為相對豐度第2出現的樣品數量最多。所有樣品中，除樣品BJ4(96.88%)外，其他樣品中存在的接合酵母屬、假絲酵母屬、酒香酵母屬和酵母目相對豐度之和均在99%以上，其中樣品SD1僅含有接合酵母屬，樣品SY6含菌屬種類最多。表明接合酵母屬、假絲酵母屬、酒香酵母屬和酵母目共為紅茶菌樣品的優勢酵母。另外，畢赤酵母屬(Pichia)、粗糙孔菌屬(Trechispora)、馬拉色菌屬(Malassezia)、鐮刀菌屬(Fusarium)、鎖霉屬(Itersonilia)和枝孢菌屬(Cladosporium)等也在部分樣品中少量出現。

2.5.2 基于感官評價的物種分析

對3組不同感官評價樣品中真菌組成進行分析(圖5)，真菌種類38種，共有物種6個，包括接合酵母屬的1個種(序列數為149 574)、酒香酵母屬的2個種(總序列數和為132 427)、假絲酵母屬的1個種(序列數為74 445)、酵母目的1個種(序列數為40 128)和肉座菌目(Hypocreales)的1個種(序列數為584)。感官評價為好的組特有真菌種類有6個，其中假絲酵母屬相對豐度最高(46.20%)，接合酵母屬次之(19.88%)；評價為中的組特有真菌種類有7個，其中接合酵母屬相對豐度最高(68.48%)，酒香酵母屬次之(29.17%)；評價為差的組特有真菌種類有12個，其中畢赤酵母屬相對豐度最高(48.24%)，酒香酵母屬次之(35.13%)。

圖5 不同感官評價分組中共有和特有真菌物種韋恩圖Fig.5 Venn diagram of common and endemic fungus species based on sensory evaluation

3組不同感官評價分組(圖6)中unspecifiedZygosaccharomyces豐度最高，其次為unspecifiedBrettanomyces、unspecifiedCandida、酵母目的1個種、肉座菌目的1個種。表明接合酵母屬和酒香酵母屬是構成紅茶菌中酵母的優勢菌屬，其次是假絲酵母屬和酵母目。MARSH等[15]研究發現大多數紅茶菌樣品中接合酵母屬占比達95%以上，王潔琛等[18]也從紅茶菌樣品中分離出二孢接合酵母(Zygosaccharomycesbisporus)，ARIKAN等[19]同樣發現紅茶菌中優勢真菌為接合酵母屬，與本文研究樣品SD1、SD10、SX11和SY6優勢真菌表現一致。TRAN等[21]從紅茶菌樣品中分離出酒香酵母和有孢漢遜酵母(Hanseniaspora)，蘇家躍等[22]從紅茶菌樣品中分離出異酒香酵母(Brettanomycesanomalus)，蔣立文[23]與林娟等[24]皆在紅茶菌樣品中分離出假絲酵母，表明不同來源紅茶菌樣品優勢酵母種類差異較大。根據圖6可以初步推測假絲酵母屬與接合酵母屬適當比例混用能促進紅茶菌好的風味物質形成，高水平的酒香酵母屬和畢赤酵母都會使紅茶菌風味變差。檀馨悅等[16]總結發現復配多種非釀酒酵母可提高紅茶菌風味的豐富程度，WANG等[25]混菌發酵制備的紅茶菌與傳統菌膜的風味相近，因此，利用適當比例混合優勢酵母發酵有助于標準化生產味道更接近傳統風味的紅茶菌飲品。此外，肉座菌目在一定范圍內相對含量越低越好，畢赤酵母、球囊菌、粗糙孔菌、牛肝菌、曲霉鐮刀菌和枝孢菌的出現會使紅茶菌感官變差。

a-門水平；b-屬水平圖4 不同紅茶菌樣品中真菌在門水平和屬水平上的相對豐度Fig.4 Relative frequency of fungus in different kombucha samples at phylum and genus levels

圖6 不同感官評價分組真菌物種熱圖Fig.6 Heatmaps of fungus based on sensory evaluation at species levels

3 結論

通過擴增子測序技術對11個紅茶菌樣品中的微生物多樣性進行分析，確定不同紅茶菌樣品中優勢細菌為葡糖醋桿菌屬(相對豐度為85.40%～99.56%)，其次為假單胞菌屬(相對豐度為<14%)；優勢真菌種類差異較大，樣品SD1、SD10、SX11和SY6中優勢菌屬為接合酵母屬(相對豐度為95.43%～99.99%)，樣品BJ4和GD9中優勢菌屬為假絲酵母屬(相對豐度為40.54%和97.40%)，樣品AH7、AH8、AJ2、BJ3和XJ5中優勢菌屬為酒香酵母屬(相對豐度為54.81%～74.09%)。

基于感官評價對微生物種類進行聚類分析發現，非優勢細菌和優勢真菌會不同程度地影響紅茶菌的風味。細菌中假單胞菌屬與紅茶菌的風味呈相關性，假單胞菌屬在一定范圍內相對含量越高風味越佳。真菌中接合酵母屬與假絲酵母屬水平相對偏高，酒香酵母屬與酵母目水平相對偏低有利于紅茶菌良好風味的形成。硫桿菌、紅球菌、瘤胃球菌、擬桿菌、普氏菌和Enterobacteriaceae等細菌，畢赤酵母、球囊菌、粗糙孔菌、牛肝菌、曲霉鐮刀菌和枝孢菌等真菌的少量出現都會使紅茶菌風味變差。

綜上所述，利用葡糖醋桿菌和接合酵母、酒香酵母等多種非釀酒酵母混菌發酵，并嚴格控制過程微生物污染，可能有助于穩定生產接近于傳統紅茶菌風味的飲品，為工業化生產紅茶菌飲品提供理論依據。