熱應(yīng)激條件下不同抗氧化添加劑對蛋雞腸道結(jié)構(gòu)的影響

陸建強，徐晨杰，聶根基，陸新富，沈素娥，虞德兵，王德前，李雙茂，李進軍

(1. 建德市建珂養(yǎng)殖有限公司，浙江 建德 311600;2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095;3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

熱應(yīng)激是夏季影響畜禽生長發(fā)育與健康的重要因素之一。隨著全球性氣候變暖以及現(xiàn)代養(yǎng)雞業(yè)規(guī)模化、集約化發(fā)展，季節(jié)性高溫和較高的飼喂密度可引起雞的熱應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致雞生產(chǎn)、繁殖性能下降，免疫功能降低，嚴重影響雞的肉、蛋產(chǎn)品質(zhì)量和數(shù)量，給現(xiàn)代養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。

蛋雞熱應(yīng)激是指在高溫環(huán)境下蛋雞體溫調(diào)節(jié)及生理機能趨于紊亂而發(fā)生的一系列異常反應(yīng)，可對采食量、生產(chǎn)性能、飼料轉(zhuǎn)換率等造成不同程度的影響，甚至導(dǎo)致熱休克或死亡。同時，熱應(yīng)激會損害雞的腸道形態(tài)和腸道屏障的完整，導(dǎo)致腸道對飼料的消化和吸收能力降低，毒素和游離抗原向腸道滲透。因此，研究蛋雞的腸道結(jié)構(gòu)可以反映蛋雞的抗熱應(yīng)激能力。

在飼糧中添加適宜的添加劑有助于緩解畜禽熱應(yīng)激[3-6]。益生菌作為一種飼料添加劑，在畜禽熱應(yīng)激方面的研究得到了很多的關(guān)注。因為益生菌可以改善機體的生理環(huán)境、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)，從而提高高溫環(huán)境下雞的生產(chǎn)性能[7]。本試驗中微生態(tài)制劑(添加劑B)富含乳酸菌、酵母菌、芽孢菌等有益微生物，同時富含有機酸、小分子生物肽等活性成分，有研究表明[8]在蛋雞飼糧中添加100 mg/kg的添加劑B可以緩解應(yīng)激，提高5.6%產(chǎn)蛋率，降低40%死淘率，提高生產(chǎn)性能，但其對蛋雞腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)改變的具體影響的研究報道較少。

姜黃素是姜黃中的有效成分，作為一種植物提取物，其廣泛存在于姜科姜黃屬多年生植物，如姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中[9]。在過去幾十年中，姜黃素的研究主要集中在抗氧化、抗炎、降脂、癌癥化學(xué)預(yù)防和潛在的化學(xué)治療性質(zhì)等醫(yī)藥學(xué)方面[10]。姜黃素具有改善家禽生產(chǎn)性能、提高免疫力的作用。研究表明，分別添加200和250 mg/kg的姜黃素，可使肉雞全期增重提高4.48%和1.59%，料重比降低7.39%和6.40%[11]，其中200 mg/kg的劑量效果極顯著[12]。此外，姜黃素還有緩解熱應(yīng)激的作用[13]。但目前姜黃素對蛋雞熱應(yīng)激影響的研究報道仍較少，需要做進一步的驗證。茶多酚是以α-苯基苯并吡喃為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的類黃酮類化合物。作為天然抗氧化劑，茶多酚可以幫助改善家禽生產(chǎn)性能，其主要通過清除家禽體內(nèi)大量因熱應(yīng)激產(chǎn)生的自由基來緩解熱應(yīng)激反應(yīng)[14],但其對蛋雞腸道結(jié)構(gòu)的影響研究報道較少。

本試驗以熱應(yīng)激條件下蛋雞作為研究對象，通過在基礎(chǔ)日糧中添加不同水平添加劑，比較這些添加劑對蛋雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，探討姜黃素、茶多酚及乳酸菌對緩解蛋雞熱應(yīng)激的作用效果，以期為高溫環(huán)境下科學(xué)飼喂蛋雞提供方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

姜黃素粉(姜黃素≥98.8%)由廣州歐虎公司提供，添加劑A(茶多酚≈2%)和添加劑B(微生態(tài)制劑含≥300億乳酸菌)由無錫三智生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗動物與設(shè)計

本試驗過程符合南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院《實驗動物管理條例》(SYXK2011-0036)要求。試驗在浙江省建德市建珂養(yǎng)殖有限公司進行，擇取體況相近的30周齡海蘭蛋雞2 400只隨機分為5組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)120只，分別飼喂：試驗組A，200 mg/kg姜黃素+基礎(chǔ)日糧；試驗組B，150 mg/kg添加劑A+基礎(chǔ)日糧；試驗組C，100 mg/kg姜黃素+150 mg/kg添加劑A+基礎(chǔ)日糧；試驗組D，150 mg/kg添加劑A+200 mg/kg添加劑B+基礎(chǔ)日糧；對照組O，基礎(chǔ)日糧。每天飼喂混合日糧2次，每組每天飼喂27.6 kg，飼養(yǎng)方式為4層階梯式籠養(yǎng)，每籠5只雞。試驗時間為2018年7月10日至2018年8月27日，其中2018年7月10日至2018年7月16日共7 d為預(yù)試期，7月17日至8月27日為正試期42 d。試驗期間雞舍內(nèi)風(fēng)機濕簾等降溫設(shè)施停止使用，日平均溫度維持在36 ℃以上，可見各組蛋雞飲水增加，糞便變濕且翅膀張開,精神萎靡。試驗期間自由飲水，飼養(yǎng)結(jié)束后，每個重復(fù)任取4只雞屠宰后剖開腹腔，迅速在十二指腸、空腸、回腸中段采集腸道樣品置于4%多聚甲醛中固定，制作切片，進行HE染色。

1.3 試驗方法

1.3.1 石蠟包埋

組織經(jīng)刀片適當(dāng)修整后的腸段用4%多聚甲醛固定 24 h 70%乙醇 3(次)× 24 h/次，依次經(jīng)過70%乙醇1 h，85%乙醇1 h，95%乙醇1 h，100%乙醇Ⅰ 30 min，100%乙醇Ⅱ 1 h，100%乙醇Ⅲ過夜；50%乙醇和50%二甲苯混合液 30 min，二甲苯Ⅰ 30 min，二甲苯Ⅱ 40 min；50%二甲苯和50%石蠟混合液30 min，石蠟Ⅰ 1 h，石蠟Ⅱ 1 h；將透蠟成功的組織塊浸入含有石蠟的包埋框中并做好標記，冷凝后取出石蠟包埋的組織；每個樣本制作6張切片，切片厚度為6 μm，在40 ℃水浴鍋中展片，在42 ℃烘片機上烘24 h后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 HE染色及切片觀察

切片依次經(jīng)過二甲苯Ⅰ 10 min，二甲苯Ⅱ 10 min，50%乙醇和50%二甲苯混合液 5 min，100%乙醇 2(次)× 2 min/次，95%乙醇 2 min，85%乙醇2 min，70%乙醇 2 min， 50%乙醇 2 min，蒸餾水2 min；蘇木精染色 30 ～ 45 s (看著色情況)；自來水沖洗 5 min，蒸餾水 2(次)× 3 min/次；50%乙醇 2 min，70%乙醇 2 min，85%乙醇 2 min，伊紅染色 10～15 s；95%乙醇 2(次)× 2 min/次，100%乙醇 2(次)× 2 min/次 ，二甲苯 2(次)× 5 min/次；樹脂封片后，在光學(xué)顯微鏡下選出2～3個典型視野，每個視野于光學(xué)顯微鏡下(40×)采用ScopeImage 9軟件測量10根小腸絨毛高度、隱窩深度、黏膜厚度及肌層厚度，并計算絨毛高度與隱窩深度比值(V/C)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件對組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05表示差異顯著，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加劑對蛋雞空腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可見，試驗組與對照組的空腸黏膜結(jié)構(gòu)皆較為完整，絨毛規(guī)則且均勻一致。表1結(jié)果表明，與對照組相比，A、B和C組的空腸絨毛高度分別顯著提高了7.73%、17.93%及43.93%(P<0.05)，D組與對照組相比差異不顯著(P=0.12)，但也提高了3.38%；與A組相比，B和C組分別提高了9.47%和33.60%，達到了顯著水平(P<0.05)，D組則差異不顯著(P=0.18)；與D組相比，B和C組分別提高了14.08%及39.22%，達到了差異顯著水平(P<0.05)；與B組相比，C組提高了22.04%，達到了顯著水平(P<0.05)。與O組相比，A、B、C和 D組空腸的隱窩深度差異不顯著(P=0.08)。

表1 不同添加劑飼喂42 d對蛋雞空腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

A. 對照組O；B. 試驗組A；C. 試驗組B；D. 試驗組C；E. 試驗組D

空腸的V/C值，與對照組相比，B和C組分別提高了7.96%及29.23%，達到了顯著水平(P<0.05)，A和D組與之相比則差異不顯著(P=0.11)；與A組相比，B和C組分別提高了14.59%及37.17%，達到了顯著水平(P<0.05)，D組則差異不顯著(P=0.09)；與D組相比，B和C組分別提高了8.27%及29.61%，達到了差異顯著水平(P<0.05)；與B組相比，C組提高了19.71%，達到了差異顯著水平(P<0.05)。

空腸的黏膜厚度，與對照組相比，A、B、C組分別提高了6.46%、21.37%及41.13%，達到了顯著水平(P<0.05)，D組與之相比則差異不顯著(P=0.21)；與A組相比，B和C組分別提高了14.00%及32.56%，達到了差異顯著水平，D組與之相比則差異不顯著(P=0.09)；與D組相比，B和C組分別提高了16.61%及35.59%，達到了差異顯著水平(P<0.05)；與B組相比，C組提高了16.27%，達到了差異顯著水平(P<0.05)。空腸的肌層厚度與對照組相比，飼糧添加姜黃素等添加劑對肌層厚度均無顯著影響(P=0.16)。

2.2 不同添加劑對蛋雞回腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可見，試驗組的回腸黏膜結(jié)構(gòu)較為完整，絨毛規(guī)則且均一，而對照組絨毛輪廓較不清晰。表2結(jié)果表明，回腸的絨毛高度，與對照組相比，A、B、C和D組分別提高了12.39%、11.48%、42.03%及17.64%，均達到了顯著水平(P<0.05)；與A組相比，C和D組分別提高了26.37%及4.68%，達到了顯著水平(P<0.05)，B組則差異不顯著(P=0.09)；與B組相比,C和D組分別提高了27.40%及5.53%，達到了顯著水平；與D組相比，C組提高了20.73%，達到了顯著水平(P<0.05)。

表2 不同添加劑飼喂42 d對蛋雞回腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

A. 對照組O；B. 試驗組A；C. 試驗組B；D. 試驗組C；E. 試驗組D

回腸的隱窩深度，與對照組相比，A、B、C和D組差異不顯著(P=0.21)。

回腸的V/C值，與對照組相比，C和D組分別提高了40.75%及23.55%，達到了顯著水平(P<0.05)，A和B組則差異不顯著(P=0.14)，但也分別提高了7.48%和8.79%；與A組相比，C和D組分別提高了30.96%和14.96%，達到了差異顯著水平(P<0.05)，B組則差異不顯著(P>0.05)；與B組相比，C和D組分別提高了29.38%及13.57%，達到了差異顯著水平(P<0.05)；與D組相比，C組提高了13.92%，達到了差異顯著水平(P<0.05)。

回腸的黏膜厚度，與對照組相比A、B、C和D組分別提高了11.04%、9.97%、39.86%及16.35%，達到了差異顯著水平(P<0.05)；與A組相比，C和D組分別提高了25.95%及4.78%，達到了差異顯著水平(P<0.05)，B組與之相比則差異不顯著(P=0.18)；與B組相比，C和D組分別提高了27.18%及5.81%，達到了差異顯著水平(P<0.05)；與D組相比，C組提高了20.20%，達到了差異顯著水平(P<0.05)。

回腸的肌層厚度，與對照組相比，A、B、C和D組差異不顯著(P=0.23)。

2.3 不同添加劑對蛋雞十二指腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可見，試驗組的回腸黏膜結(jié)構(gòu)較為完整，絨毛規(guī)則且均一，而對照組絨毛高度較短，輪廓不清晰。由表3可知十二指腸的絨毛高度，與對照組相比，B、C和D組分別提高了9.47%、34.89%及26.86%，達到了差異顯著水平(P<0.05)，A組與之相比則差異不顯著(P=0.09)，但也提高了5.25%；與A組相比，C和D組分別提高了28.16%及20.52%，達到了顯著水平(P<0.05)，B組則差異不顯著(P=0.12)；與B組相比，C和D組分別提高了23.22%及15.88%，達到了差異顯著水平(P<0.05)；與D組相比，C組提高了6.33%，達到了顯著水平(P<0.05)。

A. 對照組O；B. 試驗組A；C. 試驗組B；D. 試驗組C；E. 試驗組D

表3 不同添加劑飼喂42 d對蛋雞十二指腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

十二指腸的隱窩深度，與對照組相比，A、B、C和D組差異不顯著(P>0.05)。

十二指腸的V/C值，與對照組相比，C和D組分別提高了28.33%及18.89%，達到了差異顯著水平(P<0.05)，A和B組則差異不顯著(P=0.11)，但也分別提高了7.49%和4.40%；與A組相比，C和D組分別提高了19.39%及10.61%，達到了差異顯著水平(P<0.05)，B組則差異不顯著(P=0.14)；與B組相比，C和D組分別提高了22.93%及13.88%，達到了差異顯著水平(P<0.05)；C和D組則差異不顯著(P>0.05)。

十二指腸的黏膜厚度，與對照組相比，B、C和D組分別提高了9.55%、28.54%及24.71%，達到了差異顯著水平(P<0.05)，A組與之相比則差異不顯著(P=0.07)，但也提高了4.48%；與A組相比，B、C和D組分別提高了4.85%、23.03%及19.36%，達到了差異顯著水平(P<0.05)；與B組相比，C和D組分別提高了17.33%及13.84%，達到了差異顯著水平(P<0.05)；C和D組則差異不顯著(P=0.13)。

十二指腸的肌層厚度，與對照組相比，A、B、C和D組差異不顯著(P=0.21)。

3 討論

腸道是機體營養(yǎng)消化的重要部位,其生理狀態(tài)直接影響營養(yǎng)的消化、吸收和運輸,對動物體的生長發(fā)育起著重要作用，影響家禽抵抗疾病的能力,也影響生產(chǎn)性能[15]。此外,家禽腸道也是一個與外界溝通的重要渠道,是阻止病原體和外部抗原感染的重要部位，并有免疫、內(nèi)分泌和屏障功能，對防止腸源性感染起著重要的作用[16]。在家禽處于高溫環(huán)境時，不同年齡的多種家禽腸道組織結(jié)構(gòu)均可受到損傷。高溫環(huán)境可導(dǎo)致肉雞空腸絨毛高度的降低與表面積縮小，也嚴重損害了蛋雞空腸和十二指腸絨毛[17-18]。本試驗HE染色結(jié)果顯示，與添加抗氧化劑組相比，對照組空腸與十二指腸絨毛輪廓不清晰，十二指腸絨毛短小且發(fā)生損壞，而各添加抗氧化劑組則各段腸道黏膜結(jié)構(gòu)較為完整，尤其是姜黃素添加組絨毛規(guī)則且均一，輪廓清晰。結(jié)果表明飼糧添加抗氧化劑可以在高溫環(huán)境下有效保護蛋雞腸絨毛結(jié)構(gòu)的完整性，從而促進蛋雞的生長發(fā)育與生產(chǎn)，且本試驗中以姜黃素效果最為顯著。

腸道絨毛高度的增加會使小腸接觸營養(yǎng)物質(zhì)的面積增大，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，所以，腸絨毛高度能夠直接反映機體的生長發(fā)育能力[19]。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加劑組均使腸道絨毛高度增加并達到了顯著水平，表明姜黃素、茶多酚及微生態(tài)制劑均對蛋雞小腸絨毛高度的提高有積極作用，因此緩解熱應(yīng)激能夠使腸道絨毛高度得到改善。與對照組相比，添加100 mg/kg姜黃素+150 mg/kg添加劑A對絨毛高度的改善效果最佳，分別提高了43.93%、42.03%及34.89%。

隱窩深度反映了上皮細胞的增殖率和成熟度，隱窩細胞在其從底部向絨毛上部遷移的過程中逐漸分化，形成具有吸收能力的柱狀細胞，隱窩變淺，表明細胞增殖率上升，分泌功能增強[20]。試驗組隱窩深度無顯著變化，表明姜黃素、茶多酚及微生態(tài)制劑對蛋雞小腸隱窩深度無不良影響。

V/C值夠綜合反映小腸的功能狀況，比值提高表明吸收能力較強，比值下降則表明腸道吸收能力下降。本試驗發(fā)現(xiàn)，試驗組V/C值與對照組相比均有不同程度的提高，表明緩解熱應(yīng)激后蛋雞小腸吸收能力增強。添加100 mg/kg姜黃素+150 mg/kg添加劑A使空腸、回腸和十二指腸的V/C值分別提高了29.23%、40.75%及28.33%，效果顯著。

腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)的完整性與腸黏膜屏障功能有直接聯(lián)系，腸黏膜機械屏障由腸黏膜上皮細胞、上皮細胞側(cè)面的細胞連接、上皮基膜和上皮表面的細胞衣組成，它們構(gòu)成了機體免疫系統(tǒng)的第一道防線。因此，腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)的完整性與機體免疫存在密切關(guān)系[21]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試驗組黏膜厚度均得到了顯著提高，表明緩解熱應(yīng)激維持了腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)的完整性，可改善腸黏膜系統(tǒng)的屏障功能，對蛋雞免疫方面應(yīng)有一定積極作用。試驗條件下，飼料添加100 mg/kg姜黃素+150 mg/kg效果最佳，使空腸、回腸和十二指腸黏膜厚度分別提高了41.13%、39.86%及28.54%。

綜上所述，在本試驗條件下飼料添加姜黃素、茶多酚及微生態(tài)制劑對熱應(yīng)激條件下的蛋雞腸道隱窩深度及肌層厚度無負面作用，但顯著提高了絨毛高度、V/C值及黏膜厚度，保證腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，提示飼料添加姜黃素、茶多酚及微生態(tài)制劑對蛋雞熱應(yīng)激有緩解作用，其中飼料添加100 mg/kg姜黃素+150 mg/kg添加劑A的作用效果最好。