貝氏隱孢子蟲及其與大腸桿菌共感染對雛雞腸道菌群的影響

黃燕，陳宇，米榮升，左佳坤，王志豪，韓先干，劉永杰，陳兆國*

(1. 南京農業大學動物醫學院/動物健康與食品安全國際聯合實驗室，江蘇 南京 210095；2. 中國農業科學院上海獸醫研究所/農業農村部動物寄生蟲重點實驗室/農業農村部動物產品質量安全生物性危害因子風險評估實驗室(上海)，上海 200241)

伴隨規模化養雞業的蓬勃發展，集約化養殖造成寄生蟲、細菌和病毒等感染的狀況日益嚴重，給養雞業帶來嚴重的經濟損失。貝氏隱孢子蟲(Cryptosporidiumbaileyi，C.baileyi)是感染雞的優勢蟲種，主要侵犯呼吸道、法氏囊、腸道和泄殖腔等部位[1-2]。有報道稱雛雞感染貝氏隱孢子蟲后造成新城疫疫苗和禽流感疫苗的接種失敗[3]。禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli，APEC)是危害養禽業的重要傳染病病原之一[4]，有非常高的傳染率和死亡率。這兩種病原體常常共同感染雞群，與禽類的“腸毒綜合征”[5]密切相關。

胃腸道微生物群落(microbial community in gastrointestinal tract)對動物健康起重要作用。眾多研究報道，腸道菌群在營養吸收、飼料消化和免疫調節等方面發揮關鍵作用[6-10]。近年來，對腸道寄生蟲與菌群相互作用研究發現，原蟲或蠕蟲感染均可導致腸道微生物組成和多樣性的改變，對宿主的具體致病作用和影響則與蟲種有關[11]。此外，部分腸道菌群也影響致病菌對機體的感染與危害。對腸道菌群的綜合分析可以更好地了解致病微生物之間的互作和多樣性，而目前關于貝氏隱孢子蟲單獨以及合并感染大腸桿菌后宿主腸道菌群的變化還未見報道。鑒于此，本研究通過16S rRNA測序技術，探究貝氏隱孢子蟲單獨以及合并感染大腸桿菌后雛雞糞樣中菌群的變化，為后續相關致病機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲株和菌株

C.baileyi自雞體內分離，并由中國農業科學院上海獸醫研究所農業部動物產品質量安全生物性危害因子風險評估實驗室傳代保存。大腸桿菌DE17為APEC的臨床分離株，來源于2008年安徽省的患病鴨[12]，由中國農業科學院上海獸醫研究所韓先干研究員饋贈。

1.2 實驗動物和分組

健康SPF級1日齡巴布考克雄性雛雞30只，購自浙江立華農業科技有限公司(動物合格證編號為LHNY20190514)，試驗過程對動物的處理符合動物倫理標準。將30只1日齡SPF雛雞隨機分為3組，分別為貝氏隱孢子蟲單獨感染組(A)、貝氏隱孢子蟲和大腸桿菌混合感染組(B)和健康對照組(N)，每組10只。

1.3 接種和樣本采集

各組SPF級1日齡巴布考克雄性雛雞適應性喂養4 d后，A組雛雞灌胃接種貝氏隱孢子蟲1×106個/只；B組肌肉注射大腸桿菌DE17 2×106CFU/只，同時灌胃接種貝氏隱孢子蟲 1×106個/只；N組為健康對照組。于接種后第3、9、15、21和27天采集3組新鮮糞便，放到標記后的5 mL糞樣采集盒中，-80 ℃冰箱保存待用。

1.4 基因組DNA的提取和PCR擴增

使用土壤DNA提取試劑盒(MP，USA)提取樣本基因組DNA，利用紫外分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至20 ng/μL。所有提取的基因組DNA存放于-20 ℃保存。

以稀釋后的基因組DNA為模板，選擇細菌16S rRNA V3-V4測序區域，使用帶Barcode的特異引物，正向引物為343F (5 ′- TACGGRAGGCAGCAG -3 ′)，反向引物為798R (5 ′- AGGGTATCTAATCCT -3 ′)。2×Gflex PCR Buffer 15 μL、Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 U/μL) 0.6 μL、Primer F(5 pmol/μL) 1 μL、Primer R(5 pmol/μL) 1 μL、樣本DNA模板2.5 μL，其余用ddH2O補足，組成30 μL反應體系。反應條件：94 ℃初始變性5 min； 94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s， 26個循環；72 ℃延伸5 min，并保持在4 ℃。每份樣本進行3個技術重復。通過2%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠提取試劑盒(AXYGEN，USA)回收目的片段。

1.5 文庫構建和測序

利用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit進行文庫構建，并使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit (Invitrogen，USA)和Q-PCR對文庫質量進行鑒定。用NaOH將序列變性為單鏈后進行測序。采用Illumina MiSeq測序平臺和相應的MiSeq Reagent Kit V3進行測序。使用Trimmomatic軟件對原始雙端序列進行去雜，利用FLASH軟件得到清潔數據(clean tags)，每組數據量分布在38 014～41 971條之間。使用UCHIME軟件進行嵌合體過濾，每組得到的數據量分布在23 508～37 135條之間，平均長度為431.72～439.52 bp范圍內的有效數據(valid tags)，可用于后續分析(表1)。

表1 各組樣品菌群測序數據質控比較

1.6 生物信息學分析

將所有樣品的有效數據采用Vsearch軟件，以97%的相似性將序列聚類成為運算分類單位 (operational taxonomic units，OTUs)，再利用QIIME軟件挑選出各個OTUs的代表序列，使用Greengenes數據庫和RDP classifier軟件對所有代表序列進行比對和注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。對OTUs進行豐度分析，利用Biology diversity Pro軟件進行Alpha多樣性分析(Chao1、Shannon和Simpson指數)，用以得到各組共有和特有的OTUs信息，進行PCoA分析。根據OTUs的物種注釋結果，選取樣品所在門(Phylum)和屬(Genus)上豐度排名前15的物種，生成物種相對豐度圖，觀察各組樣品在門和屬水平上的差別。

1.7 數據統計與分析

利用SPSS 19.0軟件進行分析處理。所有數據用“平均數±標準差”表示，多組間的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 OTUs聚類分析

對valid tags進行OTUs分類，各樣本OTUs個數分布在109～328之間；樣品差異統計顯示，差異OTUs個數為170個，其中門差異個數為4個，屬差異個數為60個。各組OTUs數量差異，B組在感染后第3～15天均低于健康對照組(N組)，且第3和9天差異極顯著(P<0.01)，而第15天差異顯著(P<0.05)(圖1)。

與N組比較，**表示P<0.01，*表示P<0.05。下同

2.2 物種豐度聚類分析

聚類分析結果顯示(圖2)，相對豐度最高的門是厚壁菌門(Firmicutes)，除B組在感染第3天和第9天時的相對豐度分別為52.2%和59%之外，其他組均無顯著差異(P>0.05)。B組相對豐度排名第二的是變形菌門(Proteobacteria)，第三為擬桿菌門(Bacteroidetes)；N組和A組排名第二的為擬桿菌門，第三為變形菌門。對于變形菌門，與N組相比，B組在感染后第3、第9天相對豐度極顯著增加(P<0.001)；第15天后相對豐度開始下降，直至第27天各組之間沒有顯著差異(P>0.05)。對于擬桿菌門，B組結果剛好與變形菌門相反，前期相對豐度極顯著低于其他組(P<0.001)；到第15天后相對豐度逐步上升，縮短與其他2組的差距。

圖2 門水平不同組的物種譜

選取相對豐度排名前15的屬，其中9個屬于厚壁菌門，4個屬于變形菌門和2個屬于擬桿菌門(圖3A)；同時，選取在雞中常見的4個屬進行具體分析，即乳桿菌屬(Lactobacillus)、大腸/志賀菌屬(Escherichia-Shigella)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和布勞特氏菌屬(Blautia)。為更詳細了解各組屬之間的變化，使用相對豐度和絕對豐度同時作圖。如圖3A所示，排名前兩位的分別是隸屬于厚壁菌門的乳桿菌屬和隸屬于變形菌門的大腸/志賀菌屬，B組在感染前期(第3和第9天)的乳桿菌屬豐度顯著低于N組，而大腸/志賀菌屬則高于N組；隨后，乳桿菌屬和大腸/志賀菌屬一直處于此消彼長的狀態，即在乳桿菌屬絕對豐度高時大腸/志賀菌屬則低，直至第27天這種情況才趨于穩定(圖3B和圖3C)。排在第11位的瘤胃球菌屬和第18位的布勞特氏菌屬的絕對豐度整體呈上升趨勢，不同的是2個感染組的瘤胃球菌屬絕對豐度只有在第9天顯著低于健康對照組(圖3D)；而布勞特氏菌屬中，相較于健康對照組，2個感染組的上升趨勢較緩慢，且絕對豐度顯著低于健康對照組，尤其是共感染組(圖3E)。

A.屬水平的相對豐度；B.乳桿菌屬；C.大腸/志賀菌屬；D.瘤胃球菌屬；E.布勞特氏菌屬。與N組比較，***表示P<0.001

2.3 腸道菌群多樣性分析

表2顯示，Chao1指數伴隨時間整體呈上升趨勢；同一時間，N組與A組和B組樣品之間的Chao1指數存在顯著差異(P<0.05)。表3顯示，N組Shannon指數數值逐漸增大，且存在顯著差異(P<0.05)；A組和B組Shannon指數數值伴隨時間整體上升，但其間存在反復，且差異顯著(P<0.05)；在同一時間，與N組比，A組和B組群落多樣性豐富度降低，且除第27天，B組與N組之間存在顯著差異(P<0.05)。表4顯示，各組群落多樣性呈豐富趨勢，且各組差異顯著(P<0.05)；同一天各組之間差異顯著，第3天A組和B組與N組差異顯著(P<0.05)，第9、15和21天B組與N組差異顯著(P<0.05)，直至第27天各組之間無顯著差異(P>0.05)。

表2 不同組菌群多樣性Chao1指數比較

表3 不同組菌群多樣性Shannon指數比較

表4 不同組菌群多樣性Simpson指數比較

3 討論

機體腸道微生態環境處于動態平衡才能維持正常的腸道功能。已有研究表明，腸道菌群的失衡與宿主疾病和致病微生物(細菌或寄生蟲)的感染等因素有關[11，13]。盡管已有許多研究調查在不同情況下家禽腸道菌群的組成和變化，但是通常是研究禽類回腸和盲腸中的菌群變化，很少使用糞便中菌群變化評估腸道致病菌或寄生蟲產生的影響。根據先前的研究，整合16S rRNA V3-V4區域可能會為微生物多樣性和OTUs分類提供更好的分辨率[14-15]。因此，本研究采用16S rRNA V3-V4區域高通量測序和生物信息學技術分析對貝氏隱孢子蟲單獨以及合并感染大腸桿菌后雛雞糞便樣品中腸道菌群的變化，評估其危害性。

本研究3組雛雞腸道菌群屬的數量伴隨時間呈上升趨勢，這與隨雛雞年齡增長，其腸道微生物數量變得更加復雜相符[16-17]。多樣性和豐富度是反映腸道菌群組成的重要指標之一。Chao1指數是用來反映微生物豐富度的指標，與豐度、均勻度無關，對稀有的微生物很敏感，即數值越大則物種越豐富；Shannon指數彌補Chao1指數的不足，綜合考慮群落的豐富度和均勻度用以評估微生物多樣性，數值越大，群落多樣性越高；Simpson指數同樣是用來估算樣品中微生物多樣性的指標之一，不過其數值意義與Shannon指數相反，數值越大說明群落多樣性越低。可從Chao1、Shannon和Simpson等指數結果中觀察得到，本研究3組雛雞腸道菌群的豐富度和多樣性伴隨時間呈增長趨勢，此結果與動物腸道的成分在成長過程中從簡單變為復雜相一致[18]。其中，貝氏隱孢子蟲單獨感染與貝氏隱孢子蟲和大腸桿菌共感染皆造成腸道菌群多樣性降低，但貝氏隱孢子蟲單獨感染組的腸道菌群多樣性比共感染組先恢復，推測可能因為大腸桿菌的共感染加劇了貝氏隱孢子蟲感染引起的變化，造成其腸道菌群恢復減緩。有研究發現隱孢子蟲感染能夠導致靈長類動物腸道微生物多樣性降低[19]，而犢牛感染大腸桿菌O1后腸道菌群的豐度和多樣性發生降低[20]，這些研究與本文結果一致。

本研究選取豐度排名前15的屬對3組樣本在屬和所屬的門水平進行分析，發現3組樣本中不同菌屬的表達豐度不完全一致，說明單獨感染貝氏隱孢子蟲或混合感染大腸桿菌的雛雞腸道菌群存在差異。3組糞樣樣本腸道菌群優勢菌門中最主要的是厚壁菌門，此結果與以往的研究結果相一致，厚壁菌門在雞的各個年齡段中皆為最主要的優勢菌門，占總數的70%以上[21-23]；其次為變形菌門和擬桿菌門，但是二者的豐度高低在3組樣本中存在差異，共感染組變形菌門的相對豐度在感染后第3和第9天顯著比其他2組高，該門包含許多致病菌，如大腸桿菌、沙門菌和霍亂弧菌等。在賈第蟲感染模型中發現，賈第蟲定植可導致需氧和厭氧菌失調，表現為需氧菌變形菌門增多，厭氧菌厚壁菌門減少[24]。由于共感染組在感染貝氏隱孢子蟲的同時還感染了大腸桿菌，造成腸道微生物嚴重失衡，有害菌群急劇增多；伴隨炎癥的好轉，變形桿菌的比例逐漸回落到與其他組相同的相對豐度，而擬桿菌門的相對豐度則回升到第二位。

乳桿菌屬是動物腸道中重要的益生菌，可使腸道微生物體系發生有益的改變，可以抑制腸道內炎癥因子的產生[25-26]。本研究中，共感染組在感染后第3、第9天相較其他組乳桿菌屬相對豐度顯著降低，但在第15天開始相對豐度逐漸與其他2組相近。Yu等[18]在研究雛雞生長過程中盲腸的菌群變化時發現，乳桿菌屬和費氏桿菌屬占細菌總數的一半以上，擔任益生菌的角色。本研究中后期感染組乳桿菌屬豐度恢復，表明雛雞正在逐步恢復健康。

大腸/志賀菌屬是最為常見的腸道病原菌，共感染組相比其他2組相對豐度和絕對豐度皆顯著上升，可能與接種大腸桿菌有關。單獨感染貝氏隱孢子蟲組與健康對照組無明顯差異，表明貝氏隱孢子蟲的感染并無益于大腸/志賀菌屬細菌的增長。此結果與共感染組變形菌門豐度增高(第二位)相符。

瘤胃球菌屬和布勞特菌屬通常伴隨雛雞年齡的增長而增加[18]，這與本研究得到的結果一致。瘤胃球菌屬的增加可能會增強雛雞對炎癥的免疫力[18]；布勞特菌屬可以發酵膳食纖維產生短鏈脂肪酸(SCFAs)，SCFAs是一種具有脂肪族末端羧酸的有機酸，是腸黏膜細胞的能量來源，在葡萄糖代謝、脂質代謝和胰島素敏感性中均有調節作用[27-29]。此外，有研究報道指出SCFAs還可通過與G蛋白偶聯受體41和43結合來調節胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1, GLP-1)和酪酪肽(peptide YY, PYY)等的分泌，影響胃液分泌和胃腸蠕動[30]。2個感染組中布勞特菌屬和瘤胃球菌屬盡管伴隨雛雞日齡增長也呈現上升趨勢，但相比健康對照組絕對豐度較低，說明雛雞感染貝氏隱孢子蟲和大腸桿菌后對雛雞的采食量、免疫力和代謝功能造成影響。

綜上所述，單獨感染貝氏隱孢子蟲會造成腸道菌群結構的變化，而感染貝氏隱孢子蟲的同時再感染大腸桿菌則加劇此變化，尤其是造成腸道有害菌的豐度增加，益生菌的豐度降低；伴隨雛雞感染時間延長，感染組的腸道菌群逐漸恢復到正常狀態，但腸道菌群紊亂對雛雞采食量、免疫力和代謝功能的影響已然發生。