廣西巴馬小型豬與長白豬的BMP2和FGFR3基因序列及表達(dá)差異分析

李小楷 黃全奎 奉玲麗 郭亞芬 梁晶 蘭干球

摘要：【目的】明確廣西巴馬小型豬與長白豬的BMP2和FGFR3基因序列及表達(dá)差異，為進(jìn)一步闡明大型豬與小型豬的體型形成機(jī)制提供理論依據(jù)。【方法】以1日齡的廣西巴馬小型豬和長白豬為研究對象，采集其四肢骨生長板軟骨組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后用于擴(kuò)增BMP2和FGFR3基因的編碼區(qū)（CDS）序列，采用PCR-RFLP檢測FGFR3基因SNP位點多態(tài)性，并通過實時熒光定量PCR分析BMP2和FGFR3基因在1日齡廣西巴馬小型豬和1日齡長白豬生長板軟骨組織中的表達(dá)差異。【結(jié)果】1日齡廣西巴馬小型豬與1日齡長白豬的體型差異明顯，其體重、體長和體高的差異均達(dá)極顯著水平（P<0.01，下同），股骨長的差異達(dá)顯著水平（P<0.05，下同）。廣西巴馬小型豬和長白豬的BMP2基因CDS序列全長1188 bp，且2個品種豬的CDS序列完全一致;廣西巴馬小型豬和長白豬的FGFR3基因CDS序列全長808 bp，與NCBI已公布的FGFR3基因序列（XM_005666479.1）比對發(fā)現(xiàn)存在8個堿基突變位點及1個堿基缺失位點。廣西巴馬小型豬和長白豬共有5個錯義突變位點，分別為A124G、C190G、A204C、C205A和C245T，另外3個突變位點是廣西巴馬小型豬A438G和C549T的同義突變及長白豬A752C的錯義突變;堿基缺失位點為長白豬第328～330個堿基（GCA）缺失。FGFR3基因A2374G和C2620T位點的基因型及基因頻率在廣西巴馬小型豬與長白豬間的分布差異極顯著，對應(yīng)的等位基因分布均不符合Hardy-Weinberg平衡，且2個基因座均處于連鎖平衡狀態(tài)。1日齡廣西巴馬小型豬生長板軟骨組織中的BMP2基因相對表達(dá)量顯著低于1日齡長白豬，而FGFR3基因相對表達(dá)量極顯著高于1日齡長白豬。【結(jié)論】BMP2和FGFR3基因在豬的軟骨和骨骼形成方面具有重要意義，其中，BMP2基因?qū)ωi骨發(fā)育起促進(jìn)作用，而FGFR3基因?qū)ωi骨發(fā)育起抑制作用。廣西巴馬小型豬體型矮小與FGFR3基因高表達(dá)及BMP2基因低表達(dá)存在直接關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞： 廣西巴馬小型豬;長白豬;BMP2基因;FGFR3基因;SNP位點;體型;表達(dá)差異

Abstract：【Objective】Clarify the BMP2 and FGFR3 genes sequences and expression differences between Guangxi Bama mini pig and Landrace pig， and provide? theoretical basis for elucidating the formation mechanism of large and small pigs. 【Method】The growth plate cartilage tissue of appendicular skeleton from one-day-old Guangxi Bama mini pig and Landrace pig was used to extract total RNA. After that， the total RNA was reverse transcribed to synthesize cDNA and then used for PCR amplification of the coding region（CDS） sequence of BMP2 and FGFR3 genes. PCR-RFLP was used to detect the polymorphism of the SNP locus of FGFR3 gene. The expression differences of FGFR3 and BMP2 in one-day-old Guangxi Bama mini pig and Landrace pig were compared by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The results indicated that the body type of one-day-old Guangxi Bama mini pig and one-day-old Landrace pig were greatly different， and the differences in body weight， body length and body height were extremely significant（P<0.01， the same below）， and the difference in femoral length reached a significant level（P<0.05， the same below）. A full length of BMP2 gene CDS with 1188 bp was cloned from Guangxi Bama mini pig and Landrace pig， respectively，and the CDS sequence between the two breeds were completely consistent. The CDS sequence of FGFR3 gene with 808 bp cloned from Guangxi Bama mini pig and Landrace pig were found to have 8 base mutations and 1 base deletion when compared with the published FGFR3 sequence from NCBI（XM_005666479.1）. Five mutations， which were A124G， C190G， A204C， C205A and C245T missense mutations，were detected in Bama mini pig and Landrace pig，and A438G and C549T synonymous mutations in Guangxi Bama mini-pig and A752C missense mutation in Landrace pig were found， respectively. There were 328-330 base（GCA） deletion in Landrace pig. The genotype and gene frequency of FGFR3 gene in A2374G and C2620T loci were extremely significant difference between Guangxi Bama mini pig and Landrace pig. The corresponding allele distributions were not in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium， but the two loci were in the state of linkage disequilibrium. Compared to Landrace pig， the cartilage tissue of the growth plate of one-day-old Bama mini pig had significantly lower BMP2 expression， but the FGFR3 gene expression level was extremely significantly higher than that of Landrace pig. 【Conclusion】BMP2 gene and FGFR3 gene have important significance in the formation of cartilage and bone. Among them， BMP2 promotes the development of pig bone， and FGFR3 gene inhibits the development of pig bone. It is speculated that the short size of Guangxi Bama mini-pig is directly related to the high expression of FGFR3 and the low expression of BMP2.

Key words： Guangxi Bama mini pig; Landrace pig; BMP2 gene; FGFR3 gene; SNP site; body type; expression difference

0 引言

【研究意義】豬的品種繁多，且其體型差異明顯。成年長白豬的平均體重可達(dá)100 kg（侯建君等，2006;何道領(lǐng)，2016），而成年廣西巴馬小型豬的體重僅有45 kg左右。體型性狀是一類重要的表型性狀，測定指標(biāo)主要包括體長、體高、管圍和腹線等。豬的體型與其繁殖性狀、生長性狀和肉質(zhì)性狀等存在一定關(guān)聯(lián)。對母豬而言，體型特征與其使用年限高度相關(guān)，體型大的母豬能分娩出更多仔豬（李完波等，2016;宋志芳等，2017）。此外，體型能間接影響期望的育種目標(biāo)，對于父系豬的選育尤其重要。因此，從基因水平闡明不同豬群間的體型差異形成機(jī)制，可為開展豬育種工作提供有利的參考依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】廣西巴馬小型豬呈兩頭烏的特點，體型小，性成熟早，是我國小型豬的主要品種之一（王愛德等，2010）;具有遺傳穩(wěn)定和易于實驗操作等優(yōu)點，是研究人類異種器官或組織的優(yōu)勢動物模型（鄒迪莎和于健，2017;田永章等，2019;江雨航等，2020）。任紅艷（2014）研究發(fā)現(xiàn)，動物體型調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，外界環(huán)境因素如營養(yǎng)和溫度等能通過各種基因及信號途徑作用于細(xì)胞增殖或凋亡等多個過程，最終通過影響體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞大小而控制動物體型。Wang等（2019）研究證實，動物體型及其器官一定程度上受細(xì)胞數(shù)量和大小的影響，且生長、增殖及凋亡等細(xì)胞行為是決定動物體型的主要因素。Zhang等（2020）研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）和衛(wèi)星細(xì)胞（SC）通過調(diào)控骨組織及肌肉組織的發(fā)育而影響動物體型。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）又稱發(fā)育和分化因子（GDFs），屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）家族（Sonia，2016），積極參與腎臟發(fā)育、肢體形成、血管生成、組織纖維化及腫瘤發(fā)展等（Lin et al.，2016）。成纖維細(xì)胞生長因子受體（Fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）是一類具有自身磷酸化活性的IV型跨膜糖基化受體，其家族成員屬于酪氨酸激酶受體，在細(xì)胞增殖分化、血管生成、骨骼形成、傷口愈合及生長發(fā)育等進(jìn)程中發(fā)揮重要作用（李瀟等，2017）。FGFR3與軟骨和季肋發(fā)育不全及致死性發(fā)育不全密切相關(guān)，對軟骨發(fā)育起重要作用（莫奇非等，2019）。溫軒（2013）研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR3基因和BMP2基因在軟骨內(nèi)骨化過程中發(fā)揮重要作用。Wang等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素（DOX）介導(dǎo)BMP2釋放的基因工程祖細(xì)胞株（C3H10T1/2）可修復(fù)感染性骨缺損。此外，Sundaresan等（2019）驗證發(fā)現(xiàn)FGFR與胚胎發(fā)育及腫瘤的病理生理過程密切相關(guān);Servetto等（2021）證實FGFR與乳腺癌的信號傳導(dǎo)及內(nèi)分泌抵抗相關(guān)。【本研究切入點】不同動物間或同種動物間的體型均存在明顯差異（劉楠，2012），且各種因素交織影響著動物體型的調(diào)控機(jī)制。BMP2基因在骨組織的發(fā)生和修復(fù)中扮演重要角色，能提供成骨信號，是動物出生后骨骼內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子（劉艷等，2016）;而人類可遺傳的侏儒綜合征是由FGFR3基因錯義突變所引起（姜煜等，2017）。可見，BMPs與FGFR表現(xiàn)出完全不同的功能，二者在調(diào)節(jié)軟骨發(fā)育上可能存在相互拮抗作用，但具體機(jī)制尚未明確（Mina et al.，2002）。【擬解決的關(guān)鍵問題】從基因及其相關(guān)信號途徑調(diào)控動物體型的角度出發(fā)，分析廣西巴馬小型豬與長白豬的BMP2和FGFR3基因序列及表達(dá)差異，以期為進(jìn)一步闡明大型豬與小型豬的體型形成機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

采集1日齡廣西巴馬小型豬和1日齡長白豬的四肢骨生長板軟骨組織。其中，廣西巴馬小型豬由廣西大學(xué)廣西巴馬小型豬繁育中心提供，長白豬購自廣西里建桂寧種豬有限公司。每個品種隨機(jī)選取6頭，測量其體重及體長、體高和股骨長等體尺性狀，通過t檢驗對2個品種豬的體重和體尺性狀進(jìn)行差異顯著性檢驗。pMD18-T載體和柱式軟骨RNAout試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司;dNTPs購自生工生物工程（上海）股份有限公司;大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;血液基因組DNA提取試劑盒及Marker II購自天根生化科技（北京）有限公司;膠回收試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司;去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（Plasmid Mini Kit I）購自O(shè)MEGA公司。

1. 2 引物設(shè)計與合成

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.hih.gov/）檢索豬的BMP2基因序列（NM_001195399.1）和FGFR3基因序列（XM_005666479.1），利用Oligo 7.0設(shè)計特異擴(kuò)增引物，BMP2和FGFR3基因擴(kuò)增引物如表1所示。BMP2基因擴(kuò)增片段長度1188 bp，包含整個編碼區(qū)（CDS）序列;FGFR3基因擴(kuò)增片段長度808 bp。根據(jù)FGFR3基因CDS序列分析結(jié)果，并參考NCBI已公布FGFR3基因全序列（GenBank ID：100514115）設(shè)計擴(kuò)增引物（表1），然后利用RFLP分析FGFR3基因SNP位點多態(tài)性;同時根據(jù)FGFR3基因全序列（GenBank ID：100514115）設(shè)計特異擴(kuò)增引物，改變FGFR3-2374引物下游3'末端第1個堿基C→G及FGFR 3-2620引物下游3'末端第1個堿基C→T，引入Taq I酶切位點，Taq I可識別并切斷序列TCGA（表1）。所有擴(kuò)增引物均委托華大基因科技股份有限公司合成。

1. 3 總RNA提取及cDNA合成

采用柱式軟骨RNAout試劑盒提取廣西巴馬小型豬和長白豬的四肢骨生長板軟骨組織總RNA，檢測其濃度及純度合格后用于cDNA合成。cDNA合成步驟：7.00 μL RNA，1.00 μL gRNA Eraser，2.00 μL Buffer，42 ℃反應(yīng)2 min;然后依次加入1.00 μL反轉(zhuǎn)錄酶RT Primer Mix、4.00 μL 5×Buffer、2.00 μL抑制劑、4.00 μL dNTP、1.00 μL隨機(jī)引物及4.00 μL RNase-free Water;37 ℃ 35 min，85 ℃ 5 s。合成的cDNA置于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 PCR擴(kuò)增及測序分析

以廣西巴馬小型豬和長白豬的生長板軟骨組織cDNA為模板，分別擴(kuò)增BMP2和FGFR3基因的CDS序列。PCR反應(yīng)體系50.00 μL：Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，2×GC Buffer I（Mg+）25.00 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.00 μL，ddH2O 19.75 μL，上、下游引物各1.00 μL，cDNA模板（500 ng/μL）2.00 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行35個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。將回收純化的目的片段TA克隆至pMD18-T載體上，連接體系：Solution I 4.00 μL，pMD18-T載體1.00 μL，目的片段5.00 μL，16 ℃恒溫箱過夜;然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并接種于LA培養(yǎng)基上（含氨芐青霉素）37 ℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單克隆接種至含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h;挑取陽性菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR驗證后，將陽性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 5 BMP2和FGFR3基因CDS序列比對分析

測序獲得的廣西巴馬小型豬與長白豬的BMP2和FGFR3基因CDS序列采用DNAStar中的MegAlign進(jìn)行比對分析，并以SeqMan對測序峰圖進(jìn)行分析。

1. 6 FGFR3基因PCR擴(kuò)增及測序分析

對廣西巴馬小型豬和長白豬的FGFR3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系50.00 μL：cDNA模板（500 ng/μL）2.00 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，2×GC Buffer I（Mg+）25.00 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.00 μL，上、下游引物各1.00 μL，ddH2O 19.75 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行35個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并送至深圳華大基因股份有限公司測序，測序結(jié)果使用DNAStar中的MegAlign進(jìn)行比對分析，并以SeqMan對測序峰圖進(jìn)行分析。

1. 7 FGFR3基因SNP位點多態(tài)性分析

隨機(jī)選取廣西巴馬小型豬和長白豬各30頭，采用PCR-RFLP檢測FGFR3基因C2620T和C2374G位點多態(tài)性。Taq I酶切產(chǎn)物以2.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，記錄SNP分型;然后統(tǒng)計2個品種豬的基因型及基因頻率，經(jīng)χ2獨立性檢驗和Hardy-Weinberg平衡χ2適合性檢驗后，利用Haploview進(jìn)行連鎖不平衡分析。

1. 8 生長板軟骨組織中BMP2和FGFR3基因表達(dá)水平測定

根據(jù)NCBI已公布的BMP2和FGFR3基因序列設(shè)計實時熒光定量PCR擴(kuò)增引物（表2），采用SYBR Green I法對2個品種豬四肢骨生長板軟骨組織中的基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20.00 μL：2×SYBR? Premix Ex Taq 10.00 μL，上、下游引物各0.50 μL，cDNA模板5.00 μL，ddH2O 4.00 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行39個循環(huán);65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s。每個組織樣品設(shè)6次生物學(xué)重復(fù)，采用2?ΔΔCt法換算目的基因相對表達(dá)量，并以運用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 廣西巴馬小型豬與長白豬體重及體尺性狀的比較

1日齡廣西巴馬小型豬與1日齡長白豬的體型差異明顯，如表3和圖1所示。其中，體重、體長和體高的差異均達(dá)極顯著水平（P<0.01，下同），股骨長的差異達(dá)顯著水平（P<0.05，下同）。

2. 2 BMP2和FGFR3基因CDS序列擴(kuò)增結(jié)果

以廣西巴馬小型豬和長白豬四肢骨生長板軟骨組織總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增2個品種豬的BMP2和FGFR3基因CDS序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，約在1200和800 bp處獲得2條單一、清晰的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。廣西巴馬小型豬BMP2和FGFR3基因CDS序列的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖2所示。

2. 3 BMP2和FGFR3基因CDS序列的測序分析結(jié)果

廣西巴馬小型豬和長白豬的BMP2基因CDS序列全長1188 bp，且2個品種的CDS序列（圖3）完全一致。與NCBI已公布的BMP2基因序列比對，發(fā)現(xiàn)存在2個錯義突變位點：A298G（Arg→Gly）和T1007C（Leu→Pro）。廣西巴馬小型豬和長白豬的FGFR3基因CDS序列全長808 bp，與NCBI已公布的FGFR3基因序列比對，發(fā)現(xiàn)存在8個堿基突變位點及1個堿基缺失位點（圖4），其中5個錯義突變位點是廣西巴馬小型豬和長白豬共同所有，分別為：A124G（Asn→Asp）、C190G（Pro→Ala）、A204C（Glu→Asp）、C205A（Pro→Thr）和C245T（Ala→Vla）;另外3個突變位點是廣西巴馬小型豬A438G和C549T的同義突變及長白豬A752C（Lys→Thr）的錯義突變;堿基缺失位點為長白豬第328～330個堿基（GCA）缺失。

2. 4 廣西巴馬小型豬和長白豬FGFR3基因全序列擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)NCBI已公布的FGFR3基因全序列設(shè)計引物FGFR3-SNP-Finder1和FGFR3-SNP-Finder2，以豬基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2對引物均設(shè)在FGFR3基因內(nèi)含子區(qū)內(nèi)，擴(kuò)增范圍還包含5個外顯子區(qū)，覆蓋FGFR3基因序列的73.5%，包含廣西巴馬小型豬和長白豬FGFR3基因CDS序列的4個差異位點（3個SNP位點和1個堿基缺失位點）。其中，引物FGFR3-SNP-Finder1的預(yù)期擴(kuò)增片段長度為1470 bp，引物FGFR3-SNP-Finder2是預(yù)期擴(kuò)增片段長度為674 bp。廣西巴馬小型豬的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果（圖5）顯示，獲得的目的條帶與預(yù)期結(jié)果相符。

2. 5 FGFR3基因SNP位點篩選結(jié)果

采用MegAlign和SeqMan比對分析長白豬和廣西巴馬小型豬的FGFR3基因全序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在2個SNP位點（A2374G和C2620T）。其中，A2374G位點位于FGFR3基因第4外顯子110 bp處（圖6-A），C2620T位點位于FGFR3基因第5外顯子48 bp處（圖6-B）。此外，在2個品種豬中均存在A752C錯義突變位點和第328～330個堿基（GCA）缺失現(xiàn)象。后續(xù)選擇A2374G和C2620T位點進(jìn)行分析，以推測其與豬骨骼發(fā)育的相關(guān)性。

2. 6 FGFR3基因A2374G和C2620T位點的多態(tài)性分析結(jié)果

A2374G和C2620T位點的PCR-RFLP檢測電泳結(jié)果顯示，A2374C位點產(chǎn)生3種基因型（圖7-A），分別命名為AA（261 bp）、AB（261 bp+244 bp+17 bp）和BB（244 bp+17 bp）;C2620T位點也產(chǎn)生3種基因型（圖7-B），分別命名為MM（103 bp）、MN（103 bp+83 bp+20 bp）和NN（83 bp+20 bp）。由于17 bp和20 bp的片段太小，未能在2.5%瓊脂糖凝膠上顯示出來。

2. 7 FGFR3基因A2374G和C2620T位點在2個品種豬中的基因型及基因頻率

采用PCR-RFLP檢測A2374G和C2620T位點在廣西巴馬小型豬和長白豬中的基因型及基因頻率，結(jié)果如表4和表5所示。A2374G位點在長白豬中僅存在2種純合基因型（AA和BB），無雜合基因型（AB），優(yōu)勢等位基因A頻率為0.633;A2374G位點在廣西巴馬小型豬中存在3種基因型（AA、AB和BB），以BB基因型個體較多，優(yōu)勢等位基因B頻率為0.766。χ2適合性檢驗結(jié)果顯示，長白豬A2374G位點等位基因A/B分布不符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=29.98>χ20.005（2），P<0.01），廣西巴馬小型豬A2374G位點等位基因A/B分布也不符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=11.76>χ20.005（2），P<0.01）。χ2獨立性檢驗結(jié)果顯示，2個品種豬的A2374G位點基因頻率差異極顯著（χ2=19.55>χ20.005（1），P<0.01），基因型分布差異極顯著（χ2=15.258>χ20.005（2），P<0.01）。

C2620T位點在長白豬和廣西巴馬小型豬中均存在3種基因型（MM、MN和NN）。長白豬中NN型個體較多（頻率達(dá)0.833），優(yōu)勢等位基因N頻率為0.850;廣西巴馬小型豬中MN型個體較多（頻率達(dá)0.833），優(yōu)勢等位基因M頻率為0.516。χ2適合性檢驗結(jié)果顯示，長白豬C2620T位點等位基因M/N分布不符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=22.67>χ20.005（2），P<0.01），廣西巴馬小型豬C2620T位點等位基因M/N分布也不符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=13.42>χ20.005（2）， P<0.01）。χ2獨立性檢驗結(jié)果顯示，2個品種豬的C2620T位點基因頻率差異極顯著（χ2=18.15>χ20.005（1），P<0.01），基因型分布差異極顯著（χ2=43.17>χ20.005（2），P<0.01）。通過Haploview對豬FGFR3基因A2374G和C2620T位點進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示，連鎖不平衡系數(shù)（D）=0.044，r2=0.001<0.330，即2個基因座均處于連鎖平衡狀態(tài)。

2. 8 BMP2和FGFR3基因在2個品種豬中的表達(dá)差異

采用實時熒光定量PCR檢測BMP2和FGFR3基因在1日齡廣西巴馬小型豬和1日齡長白豬生長板軟骨組織中的表達(dá)差異，結(jié)果（表6）發(fā)現(xiàn)，廣西巴馬小型豬生長板軟骨組織中的BMP2基因相對表達(dá)量顯著低于長白豬（P<0.05），而FGFR3基因相對表達(dá)量極顯著高于長白豬（P<0.01）。

3 討論

BMPs在生物醫(yī)學(xué)再生療法和組織工程中具有潛在的治療用途（劉俊銀等，2019）。BMPs是從脊椎動物和無脊椎動物中鑒定獲得的多功能細(xì)胞因子，具有誘導(dǎo)骨骼和軟骨形成的能力（Xiao et al.，2007）。BMPs還是生長和分化因子，可為骨骼發(fā)育提供發(fā)生信號，并通過與胚胎骨形成相關(guān)的一系列信號，而促進(jìn)骨折愈合。其中，BMP2基因能誘導(dǎo)和增強(qiáng)骨生長與形成，還會促進(jìn)細(xì)胞趨化性、增殖及向成骨途徑分化（Bodern，2005;Ribeiro et al.，2015）。劉亮和王東（2007）研究發(fā)現(xiàn)，BMP2基因可成功用于治療軟骨和骨缺損。Karyagina等（2017）、Ma等（2019）研究表明，BMP2基因在骨損傷時可與骨膜、血管組織及周圍肌肉組織共同促進(jìn)骨骼愈合。FGFR是一類跨膜酪氨酸激酶受體，主要有4個家族成員（FGFR1～ FGFR4）（Ren et al.，2010）。Ornitz和Marie（2015）研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR3基因通過負(fù)反饋控制軟骨細(xì)胞向骨細(xì)胞分化，但FGFR3基因突變會導(dǎo)致其功能變強(qiáng)，進(jìn)而抑制軟骨細(xì)胞分化（Tuzon et al.，2019）。Sargar等（2017）研究發(fā)現(xiàn)FGF/FGFR信號是調(diào)節(jié)脊椎動物骨骼發(fā)育的重要信號通路。FGF/MAPK通路和BMP信號相互拮抗（Yoon et al.，2006）。Minina等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，BMPs處理可緩解軟骨發(fā)育不全小鼠模型的骨骼發(fā)育不良癥狀，而FGFR處理可中和BMPs的作用。至今，有關(guān)BMP2和FGFR3基因與豬骨發(fā)育的研究較少，與動物體型的關(guān)聯(lián)研究則更少。本研究通過克隆廣西巴馬小型豬和長白豬的BMP2和FGFR3基因CDS序列，利用PCR-RFLP檢測FGFR3基因SNP位點（A2374G和C2620T）在廣西巴馬小型豬和長白豬間的分布情況，并比較2個品種豬1日齡的體型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP2和FGFR3基因在軟骨和骨骼的形成方面具有重要意義。

本研究通過PCR-RFLP檢測A2374G和C2620T位點在廣西巴馬小型豬和長白豬中的基因型及基因頻率，結(jié)果表明，A2374G位點在長白豬中僅存在2種純合基因型（AA和BB），無雜合基因型（AB），優(yōu)勢等位基因A頻率為0.633;A2374G位點在廣西巴馬小型豬中存在3種基因型（AA、AB和BB），優(yōu)勢等位基因B頻率為0.766;C2620T位點在2個品種豬中均存在3種基因型（MM、MN和NN），長白豬的優(yōu)勢等位基因N頻率為0.850，廣西巴馬小型豬的優(yōu)勢等位基因M頻率為0.516。A2374G和C2620T位點在2個品種豬間的分布差異均極顯著，其對應(yīng)的等位基因分布均不符合Hardy-Weinberg平衡，且2個位點基因座均處于連鎖平衡狀態(tài)，推測廣西巴馬小型豬的矮小性狀與FGFR3基因堿基突變存在一定關(guān)聯(lián)。BMP2基因和FGFR3基因在豬軟骨和骨骼的形成方面具有重要意義，但其作用機(jī)制尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，廣西巴馬小型豬和長白豬在1日齡時的體重、體長、體高和股骨長存在顯著或極顯著差異，說明以這2個品種豬為研究對象比對分析動物矮小性狀的作用機(jī)制具有合理性。1日齡廣西巴馬小型豬生長板軟骨組織中的BMP2基因相對表達(dá)量顯著低于1日齡長白豬，而FGFR3基因相對表達(dá)量極顯著高于1日齡長白豬，提示BMP2基因?qū)ωi骨發(fā)育起促進(jìn)作用，而FGFR3基因?qū)ωi骨發(fā)育起抑制作用。即廣西巴馬小型豬體型矮小與FGFR3基因高表達(dá)及BMP2基因低表達(dá)有直接聯(lián)系，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

BMP2和FGFR3基因在豬的軟骨和骨骼形成方面具有重要意義，其中，BMP2基因?qū)ωi骨發(fā)育起促進(jìn)作用，而FGFR3基因?qū)ωi骨發(fā)育起抑制作用。廣西巴馬小型豬體型矮小與FGFR3基因高表達(dá)及BMP2基因低表達(dá)存在直接關(guān)聯(lián)。

參考文獻(xiàn)：

何道領(lǐng). 2016. 國外引進(jìn)豬種介紹[J]. 植物醫(yī)生，29（6）：38-39. doi：10.13718/j.cnki.zwys.2016.06.021. [He D L. 2016. Introduction of imported pig breeds from abroad[J]. Plant Doctor，29（6）：38-39.]

侯建君，施正香，李保明. 2006. 不同生長階段長白豬體型特征的主成分分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，11（3）：56-60. doi：10.3321/j.issn：1007-4333.2006.03.010. [Hou J J，Shi Z X，Li B M. 2006. Principal component analysis of Landraces physical characteristics[J]. Journal of China Agricultural University，11（3）：56-60.]

江雨航，申玉建，張其偉，高小童，張瓊文，崔悅悅，夏琴，蘭干球，郭亞芬，蔣欽楊. 2020. 廣西巴馬小型豬全身CT影像學(xué)觀察[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，51（3）：677-685. doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2020.03.026. [Jiang Y H，Shen Y J，Zhang Q W，Gao X T，Zhang Q W，Cui Y Y，Xia Q，Lan G Q，Guo Y F，Jiang Q Y. 2020. Observation of whole body CT tomography of Guangxi Bama mini-pigs[J]. Journal of Southern Agriculture，51（3）：677-685.]

姜煜，郭東煒，郭奕斌. 2017. 致死性侏儒癥Ⅰ型高發(fā)突變發(fā)生機(jī)制淺析[J]. 分子診斷與治療雜志，9（4）：278-283. [Jiang Y，Guo D W，Guo Y B. 2017. Analysis of the mechanism of high incidence of thanatophoric dysplasia type I[J]. Journal of Molecular Diagnostics and Therapy，9（4）：278-283.]

李完波，朱亞玲，艾華水，郭添福. 2016. 豬小體型相關(guān)受選擇基因位點的研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，47（10）：1977-1985. doi：10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.005. [Li W B，Zhu Y L，Ai H S，Guo T F. 2016. Identifying signatures of seletion related to small body size in pigs[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，47（10）：1977-1985.]

李瀟，王昀，陳韜亮，陳建生，黃敏，池雅杰，楊遠(yuǎn)韜，柯以銓. 2017. 成纖維細(xì)胞生長因子受體抑制劑BGJ398對膠質(zhì)瘤生物學(xué)特性的影響[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，16（6）：541-546. doi：10.3760/cma.j.issn.1671-8925.2017.06.001. [Li X，Wang Y，Chen T L，Chen J S，Huang M，Chi Y J，Yang Y T，Ke Y Q. 2017. Influence of fibroblast growth factor receptor antagonist BGJ398 in biological characte-ristics of gliomas[J]. Chinese Journal of Neuromedicine，16（6）：541-546.]

劉俊銀，馮瑋，謝映春，李豫皖，曾繼濤，劉子銘，涂小林. 2019. 骨再生修復(fù)中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路：精準(zhǔn)調(diào)節(jié)與治療靶點[J]. 中國組織工程研究，23（4）：606-612. doi：10.3969/j.issn.2095-4344.1043. [Liu J Y，F(xiàn)eng W，Xie Y C，Li Y W，Zeng J T，Liu Z M，Tu X L. 2019. Bone morphologic protein signaling pathway in bone regeneration and repair：Accurate regulation and treatment targets[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Resear-ch，23（4）：606-612.]

劉亮，王東. 2007. 大段同種異體骨移植復(fù)合BMP2和TGF-β2對兔橈骨中段骨缺損愈合的影響[J]. 中國矯形外科雜志，15（9）：702-705. doi：10.3969/j.issn.1005-8478.2007. 09.019. [Liu L，Wang D. 2007. Effects exgenous transforming growth factor-bata 2（TGF-β2） and bone morphogenetic protein 2（BMP2） and allografts bone on radius defects healing of experimental rabbits[J]. Orthopedic Journal of China，15（9）：702-705.]

劉楠. 2012. 小鼠體型控制相關(guān)miR-200s的功能研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院. [Liu N. 2012. Functional study of mouse miR-200s which related to body size control[D]. Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences.]

劉艷，尹若峰，侯睿智. 2016. BMP-2誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡及增殖的研究[J]. 中華骨與關(guān)節(jié)外科雜志，9（3）：251-254. doi：10.3969/j.issn.2095-9958.2016.03-17. [Liu Y，Yin R F，Hou R Z. 2016. Bone morpnogenetic protein 2 induced proliferation and apoptosis of chondrocytes[J]. Chinese Journal Bone and Joint Surgery，9（3）：251-254.]

莫奇非，楊鵬，蘇楠，陳林. 2019. 成纖維細(xì)胞生長因子受體在成骨細(xì)胞中的表達(dá)及作用研究[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，41（24）：2386-2392. doi：10.16016/j.1000-5404.201907 008. [Mo Q F，Yang P，Su N，Chen L. 2019. Expression of fibroblast growth factor receptor and its role in regula-ting osteoblasts differentiation[J]. Journal of Third Military Medical University，41（24）：2386-2392.]

任紅艷. 2014. 動物體型大小調(diào)控分子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，53（20）：4783-4787. doi：10.14088/j.cnki.issn0439-8114. 2014.20.003. [Ren H Y. 2014. Advances in regulation mechanisms of animal body size[J]. Hubei Agricultural Sciences，53（20）：4783-4787.]

宋志芳，邢荷巖，于國升，盧春蓮，曹洪戰(zhàn). 2017. 豬體型性狀的研究進(jìn)展及其重要性[J]. 豬業(yè)科學(xué)，34（7）：120-122. [Song Z F，Xing H Y，Yu G S，Lu C L，Cao H Z. 2017. Research progress and importance of pig body shape traits[J]. Swine Industry Science，34（7）：120-122.]

田永章，尹紀(jì)業(yè)，張?zhí)祛? 2019. 小型豬動物模型在呼吸毒理學(xué)研究中進(jìn)展[C]//中國毒理學(xué)會. 2019全國呼吸毒理與衛(wèi)生毒理學(xué)術(shù)研討會. [Tian Y Z，Yin J Y，Zhang T R. 2019. Progress of miniature pig animal models in respiratory toxicology research[C]//Chinese Society of Toxico-logy. 2019 National Symposium on Respiratory Toxicology and Hygienic Toxicology.]

王愛德，蘭干球，郭亞芬. 2010. 廣西巴馬小型豬的培育[J]. 實驗動物科學(xué)，27（1）：60-63. doi：10.3969/j.issn.1006-6179.2010.01.016. [Wang A D，Lan G Q，Guo Y F. 2010. Genetic breeding of Guangxi Bama mini-pig[J]. Laboratory Animal Science，27（1）：60-63.]

溫軒. 2013. 軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失在小鼠骨形成及骨折愈合過程中的影響及作用機(jī)制研究[D]. 重慶：第三軍醫(yī)大學(xué). [Wen X. 2013. Loss function of FGFR3 in chondrocyte affect bone formation and fracture healing in mouse[D]. Chongqing：Army Medical University.]

鄒迪莎，于健. 2017. 巴馬小型豬動物模型在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，44（4）：1128-1134. doi：10.16431/ j.cnki.1671-7236.2017.04.027. [Zou D S，Yu J. 2017. Research progress on animal models of Bama miniature pigs in the field of medicine[J]. China Animal Husban-dry & Veterinary Medicine，44（4）：1128-1134.]

Boden S D. 2005. The ABCs of BMPs[J]. Orthopedic Nursing，24（1）：49-52. doi：10.1097/00006416-200501000-00014.

Karyagina A S，Boksha I S，Grunina T M，Demidenko A V，Poponova M S，Sergienko O V，Lyashchuk A M，Galushkina Z M，Soboleva L A，Osidak E O，Bartov M S，Gromov A V，Lunin V G. 2017. Two variants of recombinant human bone morphogenetic protein-2（rhBMP-2） with additional protein domains：Synthesis in an Escherichia coli heterologous expression system[J]. Biochemistry（Moscow），82（5）：613-624. doi：10.1134/S0006297917050091.

Lin S X，Soboda K K H，F(xiàn)eng J Q，Jiang X Q. 2016. The biological function of type I receptors of bone morphogenetic protein in bone[J]. Bone Research，4：16005. doi：10.1038/ boneres.2016.5.

Ma J Y，You D，Li W Y，Lu X L，Sun S，Li H W. 2019. Bone morphogenetic proteins and inner ear development[J]. Journal of Zhejiang University（Science B），20（2）：131-145. doi：10.1631/jzus.B1800084.

Mina M，Wang Y H，Ivanisevic A M，Upholt W B，Rodgers B. 2002. Region- and stage-specific effects of FGFs and BMPs in chick mandibular morphogenesis[J]. Developmental Dynamics，223（3）：333-352. doi：10.1002/dvdy.10056.

Minina E，Kreschel C，Naski M C，Ornitz D M，Vortkamp A. 2002. Interaction of FGF，Ihh/Pthlh，and BMP signaling integrates chondrocyte proliferation and hypertrophic differentiation[J]. Devlopmental Cell，3（3）：439-449. doi：10.1016/s1534-5807（02）00261-7.

Ornitz D M，Marie P J. 2015. Fibroblast growth factor signa-ling in skeletal development and disease[J]. Genes & Development，29（14）：1463-1486. doi：10.1101/gad.266551. 115.

Ren G P，Yin J C，Wang W F，Li L，Li D S. 2010. Fibroblast growth factor（FGF）-21 signals through both FGF receptor-1 and 2[J]. Science China. Life Sciences，53（8）：1000-1008. doi：10.1007/s11427-010-4035-z.

Ribeiro F O，Gómez-Benito M J，F(xiàn)olgado J，F(xiàn)ernandes P R，García-Aznar J M. 2015. In silico mechano-chemical model of bone healing for the regeneration of critical defects：The effect of BMP-2[J]. PLoS One，10（6）：e127722. doi：10.1371/journal.pone. 0127722.

Sargar K M，Singh A K，Kao S C. 2017. Imaging of skeletal disorders caused by fibroblast growth factor receptor gene mutations[J]. Radiographics，37（6）：1813-1830. doi：10.1148/rg.2017170017.

Servetto A，F(xiàn)ormisano L，Arteaga C L. 2021. FGFR signaling and endocrine resistance in breast cancer：Challenges for the clinical development of FGFR inhibitors[J]. Biochi-mica et Biophysica Acta，22：188595. doi：10.1016/j.bbcan. 2021.188595.

Sonia S. 2016. Use of bone morphogenetic proteins in mesenchymal stem cell stimulation of cartilage and bone repair[J]. World Journal of Stem Cells，8（1）：1-12. doi：10.4252/ wjsc.v8.i1.1.

Sundaresan L，Kumar P，Manivannan J，Balaguru U M，Kasiviswanathan D，Veeriah V，Anishetty S，Chatterjee S. 2019. Thalidomide and its analogs differentially target fibroblast growth factor receptors：Thalidomide suppresses FGFR gene expression while pomalidomide dampens FGFR2 activity[J]. Chemical Research in Toxicology，32（4）：589-602. doi：10.1021/acs.chemrestox.8b00286.

Tuzon C T，Rigueur D，Merrill A E. 2019. Nuclear fibroblast growth factor receptor signaling in skeletal development and disease[J]. Current Osteoporosis Reports，17（3）：138-146. doi：10.1007/s11914-019-00512-2.

Wang M Q，Li H J，Yang Y Q，Yuan K，Zhou F，Liu H B，Zhou Q H，Yang S B，Tang T T. 2021. A3D-bioprinted scaffold with doxycycline-controlled BMP2-expressing cells for inducing bone regeneration and inhibiting bacterial infection[J]. Bioactive Materials，6（5）：1318-1329. doi：10.1016/j.bioactmat.2020.10.022.

Wang Y W，Quan S J，Ma H，Liu D H，Xie F H，Chen G C，Wang B T，An M L，Ding F. 2019. A review on the protection mechanism of trehalose on plant tissues and animal cells[J]. Agricultural Biotechnology，8（4）：29-34. doi：10.19759/j.cnki.2164-4993. 2019.04.006.

Xiao C C，Shim J，Klüppel M，Zhang S S M，Dong C，F(xiàn)lavell R A，F(xiàn)u X Y，Wrana J L，Hogan B L M，Ghosh S. 2007. Ecsit is required for BMP signaling and mesoderm formation during mouse embryogenesis[J]. Genes & Development，17（23）：2933-2949. doi：10.1101/gad.1145603.

Yoon B S，Pogue R，Ovchinnikov D A，Yoshii I，Mishina Y，Behringer R R，Lyons K M. 2006. BMPs regulate multiple aspects of growth-plate chondrogenesis through opposing actions on FGF pathways[J]. Development，133（23）：4667-4678. doi：10.1242/dev.02680.

Zhang W，Kroscher K A，Murray R L，Gagliardi R，Guiltinan C，Rhoads R P，Stahl C H. 2020. Dietary calcium and phosphorus amounts affect development and tissue-speci-fic stem cell characteristics in neonatal pigs[J]. The Journal of Nutrition，150（5）：1086-1092. doi：10.1093/jn/nxaa011.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）