氰戊菊酯等4種化學藥物對克氏原螯蝦的急性毒性及組織病理觀察

鄭瑞州 胡鯤

摘要：【目的】評價氰戊菊酯、辛硫磷、硫醚沙星和甲霜靈對克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）的急性毒性，分析其對克氏原螯蝦的組織病理影響，為生態風險評估提供基礎數據。【方法】采用靜態試驗法測定4種藥物浸泡下克氏原螯蝦的急性毒性作用，分別使用4種藥物48 h半致死濃度（LC50）和96 h-LC50的10%濃度浸泡克氏原螯蝦48和96 h后取樣，基于石蠟切片技術比較分析4種藥物對克氏原螯蝦肝胰腺和肌肉組織結構的影響。【結果】4種藥物浸泡下表現的中毒癥狀比較類似，且不同濃度組的中毒癥狀表現出明顯的劑量和時間效應。急性毒性試驗結果表明，4種化學藥物對克氏原螯蝦的毒性排序為氰戊菊酯>辛硫磷>硫醚沙星>甲霜靈。氰戊菊酯對克氏原螯蝦24、48和96 h的LC50分別為4.375、4.252和3.865 μg/L，辛硫磷對克氏原螯蝦24、48和96 h的LC50分別為161.301、87.784和81.637 μg/L，硫醚沙星對克氏原螯蝦24、48和96 h的LC50分別為76.541、72.509和52.529 mg/L，甲霜靈對克氏原螯蝦24、48和96 h的LC50分別為20.610、5.499和4.141 g/L。組織病理觀察發現，以相對低濃度的化學藥物染毒克氏原螯蝦后，仍會對克氏原螯蝦的組織產生損傷和破壞。染毒后的肝胰腺發現部分細胞破裂、皺縮、壞死，B細胞及其內部轉運泡體積明顯增大且增多，R細胞顏色加深等現象;肌肉整體呈現肌纖維斷裂溶解、細胞排列不緊密、出現明顯空腔等現象。【結論】氰戊菊酯、辛硫磷、硫醚沙星和甲霜靈對克氏原螯蝦的急性毒性具有較大差異。克氏原螯蝦在4種化學藥物的安全濃度下均能夠存活，但會對肝胰腺和肌肉組織產生破壞。

關鍵詞： 氰戊菊酯;辛硫磷;硫醚沙星;甲霜靈;克氏原螯蝦;急性毒性;組織病理

Abstract：【Objective】In order to evaluate the acute toxicity of fenvalerate， phoxim， sulfide gatifloxacin and ridomil to Procambarus clarkii， analyze the histopathological effects on P. clarkii， and provide basic data for ecological risk assessment. 【Method】The acute toxicity effects of four drugs on P. clarkii were determined by static test method. P. clarkii were soaked in four drugs for 48 and 96 h with 10% concentration of 48 h half lethal concentration （LC50） and 10% concentration of 96 h-LC50 respectively. The changes of hepatopancreas and muscle structure of P. clarkii were compared and analyzed based on paraffin section technology. 【Result】The poisoning symptoms of the four drugs were similar， and the poisoning symptoms of different concentration groups showed obvious dose and time effects. The results of acute toxicity test showed that， toxicity ranking of four chemical drugs was fenvalerate>phoxim>sulfide gatifloxacin>ridomil. The LC50 of fenvalerate to P. clarkii was 4.375， 4.252 and 3.865 μg/L at 24， 48 and 96 h.The LC50 of phoxim to P. clarkii was 161.301， 87.784 and 81.637 μg/L. 24， 48 and 96 h-LC50 of sulfide gatifloxacin to P. clarkii was 76.541， 72.509 and 52.529 mg/L. And the LC50 of ridomil for P. clarkii at 24， 48 and 96 h respectively were 20.610， 5.499 and 4.141 g/L. Histopathological observation showed that the tissues of P. clarkii were still damaged and destroyed after being exposed to rela-tively low concentrations of chemical drugs. The results showed that part of hepatopancreas cells ruptured， shrunk and necrosis， the volume of B cells and its internal transport vesicles increased greatly， and the color of R cells deepened; the whole muscle showed the phenomenon of breaking and dissolving of muscle fibers， loose arrangement of cells and obvious cavity. 【Conclusion】The acute toxicity of fenvalerate， phoxim， sulfide gatifloxacin and ridomil to P. clarkiiis different. P. clarkii can survive at the safe concentration of four chemicals， but it damages the hepatopancreas and muscle tissue.

Key words： fenvalerate; phoxim; sulfide gatifloxacin; ridomil; Procambarus clarkii; acute toxicity; histopathology

0 引言

【研究意義】克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）味道鮮美、營養豐富，價格相對較低，受到消費者的普遍歡迎，因此市場需求增加，克氏原螯蝦的養殖業迅猛發展（林偉等，2020）。據統計，2019年全國克氏原螯蝦養殖產量達208.96萬t，養殖總面積達128.6萬ha，其中稻田養殖面積為110.5萬ha，占總養殖面積的85.96%（全國水產技術推廣總站和中國水產學會，2020）。在克氏原螯蝦帶來市場價值的同時，受養殖技術水平差異、養殖戶片面追求高產等因素的影響，不可避免地引起消費者對食用小龍蝦農藥、獸藥殘留等質量安全問題的擔憂（何力等，2020）。在農藥的施用過程中僅有1%左右作用于靶生物，其余的農藥將殘留于土壤或以間接途徑進入水環境（丁中海等，2004;尚泰宇等，2019），當水中的毒性物質達到一定程度時，就可能對魚、蝦造成毒害和死亡等危害（于振海等，2017）。克氏原螯蝦體內的污染物也可通過食物鏈的富集作用被人體攝取，對人類健康構成嚴重威脅。因此，迫切需要明確水產用藥和農藥對克氏原螯蝦的急性毒性作用和影響，對制定科學合理的給藥方案提供基礎數據，保證水產品的質量安全。【前人研究進展】包括氰戊菊酯在內的擬除蟲菊酯類農藥作為一類高效、廣譜的殺蟲劑，已經廣泛應用于農業滅害和水產養殖中（徐春娟等，2018）。擬除蟲菊酯類對鳥類和哺乳動物的毒性相對較低，但對水生甲殼類動物和魚類等生物的毒性較高（Jaroslava et al.，2019）。除此之外，杜潔（2016）發現氰戊菊酯的暴露會引起斑馬魚產生發育毒性現象，且對體內氧化代謝相關的核受體基因表達具有干擾效應。辛硫磷屬于廣譜性有機磷殺蟲劑，對水產寄生蟲具有觸殺作用，能夠通過破壞菌毒組織結構等方式來阻止病原體RNA或DNA的合成（徐杭忠等，2020）。辛硫磷在內的有機磷農藥主要抑制腦突觸體膜腺苷三磷酸酶，從而使突觸體膜乙酰膽堿酯酶（AChE）等神經遞質得以累積，阻斷神經傳導，導致神經傳導功能紊亂（汪鵬鵬，2017）。硫醚沙星是一種水產養殖用的殺菌劑，對水霉病有良好的治療作用，同時對鰻弧菌（V.anguillarum）、嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）和遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）等細菌具有抑制和滅殺效果（劉國興等，2019）。甲霜靈屬酰胺類內吸性殺菌劑，主要用于莖葉、種子和土壤處理，防治霜霉菌、疫霉菌及腐霉菌引起的病害（江澤軍等，2015）。由于甲霜靈對于防治魚類水霉病具有良好的效果且對靶動物安全，常被用作一種替代孔雀石綠的新型漁用藥物以治療水產動物的水霉病（孫晶等，2020），但同時也有研究認為甲霜靈對人體健康具有潛在風險（Lidova et al.，2013）。【本研究切入點】氰戊菊酯和辛硫磷屬于高效殺蟲劑，硫醚沙星和甲霜靈屬于水產動物殺菌劑，在稻蝦綜合種養環境中使用較廣泛，但對克氏原螯蝦的安全性數據尚屬空白。【擬解決的關鍵問題】利用靜態試驗法測試4種藥物對克氏原螯蝦的急性毒性作用，研究在急性暴露條件下克氏原螯蝦肝胰腺和肌肉的病變情況，為評價環境生態風險提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

克氏原螯蝦（P. clarkii）取自江蘇省淡水水產研究所揚中基地，平均體長79.46±1.56 mm，平均體重23.63±1.53 g。先在200 L的聚乙烯水箱中暫養一周，每天定時定量投喂飼料，每24 h換水1/2水箱。試驗在上部外徑1090×800 mm、下部外徑960×690 mm、高280 mm的聚乙烯塑料箱中進行。試驗用水為充分曝氣72 h以上的自來水，水溫（18.31±0.44）℃，pH 7.87±0.04，溶解氧（OD）為7.09±1.07 mg/L。正式試驗前24 h停止投喂，且整個試驗期間不投喂飼料，全程自然光照。選取附肢齊全、體質健壯和規格統一的個體作為試驗用蝦。

主要試驗藥品與試劑：氰戊菊酯（Fenvalerate）（浙江威爾達化工有限公司生產），有效成分含量20%，產品標準號GB/T 6695—1998;辛硫磷（Phoxim）（山東埃森化學有限公司生產），有效成分含量40%，產品標準號GB 9557—2008;硫醚沙星（Sulfide gatifloxacin）（北京漁經生物技術有限責任公司生產），有效成分含量80%，執行標準號為Q/TXY JS091;甲霜靈（Ridomil）（浙江禾本科技股份有限公司生產），有效成分含量≥98%。氰戊菊酯和辛硫磷先配成母液，再稀釋成不同濃度，現用現配。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 急性毒性試驗 參考GB/T 31270.21—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則 第21部分：大型甲殼類生物毒性試驗》中關于大型甲殼類生物的靜態試驗法，并根據4種藥物對其他物種的LC50和預實驗的濃度范圍，氰戊菊酯組選擇0.1、0.3、0.9、2.7和8.1 μg/L的用藥濃度;辛硫磷組選擇2、6、18、54和162 μg/L的用藥濃度;硫醚沙星組選擇10、20、40、80和160 mg/L的用藥濃度;甲霜靈組選擇0.5、1、2、4和8 g/L的用藥濃度。每個濃度組設3個平行組，另設空白對照組，每組加水30 L，放蝦15尾。連續觀察克氏原螯蝦的活動情況和中毒癥狀，及時撈出死亡個體并記錄24、48和96 h的死亡情況。

1. 2. 2 組織病理觀察 根據急性毒性試驗得到的結果，分別選擇4種藥物對應的48 h-LC50值的10%濃度對克氏原螯蝦浸泡48 h，同時選擇4種藥物對應的96 h-LC50的10%濃度對克氏原螯蝦浸泡96 h，并設置對照組，每組加水30 L，放蝦15尾。觀察并記錄試驗期間蝦是否存在中毒和死亡現象，從試驗組和對照組每組隨機取出3只克氏原螯蝦，解剖取出肝胰腺和肌肉，經Bouins液固定24 h后，放入75%乙醇中保存備用。固定后的組織經乙醇脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精—伊紅染色和中性樹膠封片后，在顯微鏡（Olympus BX51）下觀察拍照。

1. 3 統計分析

利用Excel 2010和SPSS 21.0對試驗結果進行數理統計分析。采用直線內插法計算4種供試藥物對克氏原螯蝦的回歸方程（藥物濃度為橫坐標，死亡率為縱坐標）、回歸方程相關系數（R）以及24、48和96 h的半致死濃度（LC50）及其95%置信限，安全濃度（SC）=96 h-LC50×0.1。

2 結果與分析

2. 1 克氏原螯蝦的中毒癥狀

試驗期間，空白對照組均未發現中毒或死亡個體。所有蝦的活力好、行為正常、反應靈敏，能正常蛻殼，且出現交配行為。使用玻璃棒接近時兩螯迅速張開防御，或立即跳開躲避。4種藥物浸泡下表現的中毒癥狀比較類似，且不同濃度組的中毒癥狀表現出明顯的劑量和時間效應。中毒初期均表現為行動遲緩、反應遲鈍、機體無力，蛻殼蝦數量明顯減少，用玻璃棒接近時未見及時逃開躲避。隨著中毒時間的延長和藥物濃度的加大，克氏原螯蝦出現仰臥和側臥現象，其附肢能節律性擺動但身體不能移動，此階段沒有蝦發生蛻殼現象。最終的死亡個體多表現為弓背或身體僵直，以側臥和仰臥死亡為主。4種藥物對應的48 h-LC50值和96 h-LC50值的10%濃度分別浸泡克氏原螯蝦48和96 h后，均未出現死亡個體，僅部分蝦表現為行動遲緩和反應遲鈍。

2. 2 4種藥物對克氏原螯蝦的急性毒性效應

4種藥物對克氏原螯蝦的急性毒性試驗結果見表1。隨著4種藥物染毒時間的推移，測算得到24、48和96 h的LC50越來越低，藥物對克氏原螯蝦的毒性越來越大。由表1可知，氰戊菊酯24、48和96 h的LC50分別為4.375、4.252和3.865 μg/L，SC為0.3865 μg/L;辛硫磷24、48和96 h的LC50分別為161.301、87.784和81.637 μg/L，SC為8.1637 μg/L;硫醚沙星24、48和96 h的LC50分別為76.541、72.509和52.529 mg/L，SC為5.2529 mg/L;甲霜靈24、48和96 h的LC50分別為20.610、5.499和4.141 g/L，SC為0.4141 g/L。其中由于辛硫磷162 μg/L浸泡24 h組和甲霜靈8 g/L浸泡24 h組的死亡率未達100%，所以辛硫磷和甲霜靈的24 h的LC50值相較其對應48和96 h的LC50相差較大。

依據GB/T 31270.21—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》對藥物的毒性等級進行劃分。由于氰戊菊酯和辛硫磷的96 h-LC50≤0.1 mg a.i./L，因此二者對克氏原螯蝦的急性毒性為劇毒，硫醚沙星和甲霜靈的96 h-LC50>10 mg a.i./L，故為低毒。綜合對比4種化學藥物的LC50，4種藥物的毒性排序為氰戊菊酯>辛硫磷>硫醚沙星>甲霜靈。

2. 3 4種化學藥物暴露條件下克氏原螯蝦的組織病理觀察

根據病理切片得到的圖片僅挑選部分典型且需要說明的部分，未闡述的部分不具有代表性，因此不進行說明。

2. 3. 1 肝胰腺 健康的克氏原螯蝦肝胰腺結構由無數肝小管組成，結構正常，分布均勻。肝小管基膜完整，上皮細胞排列緊密，管腔呈星型（圖1-1）。氰戊菊酯染毒48 h后的肝小管出現嚴重損傷。在切片邊緣位置（即肝胰腺表面），發現肝小管管腔呈現明顯皺縮現象;包括B細胞在內的細胞出現破裂和空泡化現象，在切片中心位置（肝胰腺內部）未發現該現象（圖1-2）。與染毒48 h相比，氰戊菊酯染毒96 h除上述癥狀外還發現由于管腔擠壓導致的肝小管嚴重變形和細胞壞死的現象（圖1-3）。由圖1-4～圖1-8可知，辛硫磷組、硫醚沙星組和甲霜靈組均在切片邊緣位置（肝胰腺表面），發現B細胞及其內部轉運泡體積明顯增大且增多，且數量最多的組別是硫醚沙星組，其次為辛硫磷組，最少為甲霜靈組，而在切片中心位置（肝胰腺內部）未發現該現象。氰戊菊酯染毒48 h后的肝小管出現嚴重損傷。在切片邊緣位置（即肝胰腺表面），發現肝小管管腔呈現明顯皺縮現象;包括B細胞在內的細胞出現破裂和空泡化現象，在切片中心位置（肝胰腺內部）未發現該現象（圖1-2）。與染毒48 h相比，氰戊菊酯染毒96 h除上述癥狀外還發現由于管腔擠壓導致的肝小管嚴重變形和細胞壞死的現象（圖1-3）。與對照組相比，辛硫磷組染毒48 h后肝小管的部分R細胞顏色加深，同時出現呈深褐色的液泡。試驗蝦在甲霜靈中浸泡48 h后，肝小管管腔呈現大量褶皺，且管腔的單層柱狀細胞呈現增生趨勢，肝小管內出現大量褐色顆粒和部分棕色的R細胞（圖1-7）。

2. 3. 2 肌肉 由圖2-1可知，健康克氏原螯蝦肌纖維排列緊密有序，細胞核呈橢圓形，散布在肌纖維之間。氰戊菊酯組染毒48 h后，克氏原螯蝦肌肉出現嚴重損傷，主要表現為肌肉呈明顯的波浪化紋理且部分肌纖維斷裂溶解，最終導致出現明顯的空腔（圖2-2）。辛硫磷染毒96 h后，損傷的肌肉主要表現為細胞排列松散且不規則，肌纖維出現斷裂溶解，最終導致明顯的空腔（圖2-3）。硫醚沙星染毒96 h后，克氏原螯蝦肌肉呈現較輕微損傷，主要表現為細胞排列松散不緊密，肌纖維之間出現不同程度的間隙（圖2-4）。甲霜靈染毒48 h后，染毒蝦的肌肉損傷較輕微，肌纖維之間出現不同程度的間隙（圖2-5）;甲霜靈染毒96 h組的肌肉損傷比甲霜靈染毒48 h組更嚴重，主要表現為部分肌纖維失去固有形態，出現波浪化紋理（圖2-6）。

3 討論

克氏原螯蝦分布較廣，且飼養管理簡便，有望作為環境毒理和藥物毒性攻擊水生甲殼動物的模型生物（劉青，2012）。化學藥物對克氏原螯蝦的急性毒性試驗數據不僅對闡明藥物的毒性作用具有重要意義，該數據也是進行藥物安全評價的重要手段（丁正峰等，2012）。氰戊菊酯對不同水產動物的急性毒性差異較明顯。周冬仁等（2018）報道，氰戊菊酯對凡納濱對蝦的48 h-LC50為0.123 μg/L;蔣金花等（2015）研究發現氰戊菊酯對斑馬魚幼魚的96 h-LC50為0.0183 mg/L;本研究中，氰戊菊酯在克氏原螯蝦上同樣表現出很高的毒性，氰戊菊酯24、48和96 h的LC50分別為4.375、4.252和3.865 μg/L，SC為0.3865 μg/L。本研究結果發現，辛硫磷24、48和96 h的LC50分別為161.301、87.784和81.637 μg/L，SC為8.1637 μg/L;與汪鵬鵬（2017）對斑馬魚的毒性試驗結果（96 h、LC50為6.482 mg/L）差異較明顯，說明克氏原螯蝦對辛硫磷的耐受能力比斑馬魚低。本研究結果證實，硫醚沙星24、48和96 h的LC50分別為76.541、72.509和52.529 mg/L，SC為5.2529 mg/L。秦志清等（2016）報道，硫醚沙星對異育銀鯽中科3號幼魚的48 h-LC50為18.54 mg/L;周桂嫻等（2020）報道，硫醚沙星對凡納濱對蝦的48 h-LC50為0.112 mg/L;與之相比，克氏原螯蝦對硫醚沙星的忍耐力比同對蝦目的凡納濱對蝦強。甲霜靈具有廣譜高效的殺菌效果，也可用來防治水產動物由水霉菌引起的疾病（李浩然等，2015）。本研究中，甲霜靈24、48和96 h的LC50分別為20.610、5.499和4.141 g/L，SC為0.4141 g/L。在實際生產中治療水霉病大多使用甲霜靈復方制劑，其復方制劑對草魚水花、鰱魚水花和鯽魚魚苗的96 h-LD50為245 mg/L（蘇惠冰等，2017），說明甲霜靈在實際生產中不會使用特別大的劑量，且其毒性弱，不會對養殖生物造成危害。

劉曉曉（2018）選用約為96 h-LC50的10%馬度米星銨浸泡克氏原螯蝦進行亞慢性染毒研究和組織切片觀察;本研究選擇10%的48 h-LC50和96 h-LC50的藥物濃度作為低濃度試驗濃度對克氏原螯蝦進行染毒和組織切片觀察。肝胰腺是甲殼動物的重要器官，主要發揮消化、吸收、儲存和排泄等功能（孟愔等，2019）。同時，肝胰腺還是非常重要的藥物代謝器官，劉曉曉（2018）發現馬度米星銨可誘導克氏原螯蝦肝胰腺藥物代謝酶的表達，說明一些藥物會對肝胰腺產生一定影響。本研究中辛硫磷、硫醚沙星和甲霜靈處理組均導致肝胰腺外圍肝小管中B細胞及其內部轉運泡數量增多和體積增大，該結果與陶易凡等（2016）的研究結論類似。B細胞發揮分泌消化酶類及胞內消化的作用（趙衛紅等，2014）。B細胞及其內部轉運泡的變化促進了B細胞分泌的消化酶的轉運和代謝吸收，從而為環境脅迫下克氏原螯蝦提供更多的營養物質和能量以維持正常生理代謝。而R細胞具有吸收、分解代謝和儲存營養物質、分解重金屬等功能（陳忱，2015）。本研究中辛硫磷組R細胞顏色加深和出現的褐色液泡可能與營養代謝產物有關（陶易凡等，2016），但仍有待進一步確認。蝦的肌肉作為主要食用部分，其水分、粗蛋白質、粗脂肪和粗灰分等常規營養成分含量是評價肌肉品質的重要指標（萬金娟等，2020）。本研究結果表明，染毒蝦的肌肉組織主要以斷裂和溶解為主，不僅影響蝦肉的口感，還可能引起肌肉綿軟無力、功能紊亂，進而導致其應激死亡。

本研究中，各組僅以10%的LC50染毒處理即會對克氏原螯蝦肝胰腺和肌肉組織產生破壞，且組織破壞程度排序和化學藥物毒性排序同為氰戊菊酯>辛硫磷>硫醚沙星>甲霜靈。

4 結論

氰戊菊酯、辛硫磷、硫醚沙星和甲霜靈對克氏原螯蝦的急性毒性具有較大差異。克氏原螯蝦在4種化學藥物的安全濃度下均能夠存活，但會對肝胰腺和肌肉組織產生破壞。

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（責任編輯 鄧慧靈）