不同鹽度對四指馬鲅幼魚存活及鰓組織形態變化的影響

牛瑩月 羅志平 區又君 藍軍南 溫久福 李加兒 周慧

摘要：【目的】探究不同鹽度對四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）幼魚存活與鰓組織結構變化的影響，為四指馬鲅苗種生產提供有效的技術支持和理論參考。【方法】試驗設0、5‰、10‰（對照）、15‰和20‰等5個鹽度組，將暫養于鹽度為10‰水體中的四指馬鲅幼魚直接放入其他鹽度水體中，試驗第15 d時進行活體鰓組織取樣，采用組織學方法對不同鹽度條件下四指馬鲅幼魚的鰓組織結構進行研究。【結果】鹽度為0時，四指馬鲅幼魚在12 h之內全部死亡，5‰鹽度組幼魚死亡率成為6.6%，10‰對照組幼魚無死亡，15‰和20‰鹽度組幼魚死亡率分別為33.3%和60.0%，表明與高鹽環境相比，四指馬鲅幼魚更能適應低鹽環境，但不能在急性淡水脅迫條件下存活。顯微結構觀察結果顯示，10‰鹽度條件下，四指馬鲅幼魚的鰓小片排列緊密，線粒體豐富細胞主要分布在鰓小片基部。隨著鹽度增加，鰓小片的長度和間距減小，而鰓小片寬度增加。其中，5‰鹽度條件下鰓小片的長度、寬度和間距分別為45.19±3.18 ?m、5.32±1.02 ?m和17.65±1.43 ?m，20‰鹽度條件下鰓小片的長度、寬度和間距分別為36.67±3.81 ?m、8.78±2.22 ?m和11.56±3.81 ?m，差異均達顯著水平（P<0.05）。20‰鹽度條件下，鰓小片的遠端可觀察到線粒體豐富細胞，扁平上皮細胞出現一定程度的脫落或分離現象。掃描電鏡觀察結果顯示，線粒體豐富細胞的頂膜結構分為Ⅰ型（頂膜向內凹陷）和Ⅱ型（頂膜向外凸起）2種類型。5‰鹽度條件下，線粒體豐富細胞出現2種類型，主要以Ⅱ型為主，頂膜開口較大，表面有大量微絨毛，扁平上皮細胞表面有隆起的微嵴，形成指紋樣回路;10‰鹽度條件下，出現Ⅰ型線粒體豐富細胞，扁平上皮細胞表面微嵴形態不規則，細胞間的界限不明顯;15‰和20‰鹽度條件下，均以Ⅰ型結構為主，且隨著鹽度增加，頂膜加深，線粒體豐富細胞數量增多，扁平上皮細胞表面微嵴隆起幅度小，指紋樣的回路不明顯。【結論】當水體滲透壓改變時，四指馬鲅幼魚存活率及鰓小片上細胞的數量分布和形態均發生顯著變化，鰓組織結構的變化與其所處的環境鹽度條件有關。

關鍵詞： 四指馬鲅;鹽度;幼魚;死亡率;鰓;組織結構

Abstract：【Objective】In order to explore the characteristics of the survival and gill histological structure of Eleutheronema tetradactylum juveniles cultured at different salinities，to provide effective technical support and theoretical reference for the production of E. tetradactylum. 【Method】Five salinity groups of 0，5‰，10‰ （control），15‰ and 20‰ were set up in the experiment. The juvenile E. tetradactylum temporarily raised in 10‰ salinity water was directly put into other salinity water bodies. The living gill tissue was sampled on the 15th day of the experiment. The histological structure of gill of E. tetradactylum juveniles under different salinities were observed by using the histological methods. 【Result】Under 0 salinity condition，E. tetradactylum juveniles all died within 12 h，at 5‰ salinity condition，the mortality rate was 6.6%，no death in the control group，the mortality rates of 15‰ and 20‰ salinity were 33.3% and 60.0% respectively. Compared with the high salt environment，E. tetradactylum juveniles was more adaptable to low-salt environment and could not survive in freshwater environment. The microstructure observation results showed that，at 10‰ salinity condition，the gill lamella of E. tetradactylum juveniles closely arranged closely，mitochondria-rich cells were distributed at the base of the gill patch. With the increase of salinity，the length and spacing of gill lamellae decreased，while the width of gill lamellae increased. At 5‰ salinity condition，the length，width and the intervals of gill lamella were 45.19±3.18 ?m，5.32±1.02 ?m and 17.65±1.43 ?m respectively. At 20‰ salinity condition，the length，width and the intervals of gill lamella were 36.67±3.81 ?m，8.78±2.22 ?m and 11.56±3.81 ?m respectively，the differences were all significant（P<0.05）. At 20‰ salinity condition，mitochondrial rich cells could be seen at the distal end of the gill patch and the pavement epithelial cells appeared to be detached or separated. The surface scanning of the gills showed the mitochondrial rich cells could be divided into two subtypes：subtype Ⅰ（embolic apical crypts） and subtype Ⅱ（shallow apical crypts）. Under 5‰ salinity condition，there were two types of mitochondria-rich cells. Most of which were type Ⅱ，the apical membrane had a large opening and there were a large number of microvilli on the surface. The surface of pavement epithelial cells was uplifted by the microridge，forming a fingerprint-like circuit. Under 10‰ salinity condition，mitochondria-rich cells showed typeⅠ structure，the microridge on the surface of pavement epithelial cells was irregular and the intercellular boundary distribution was not obvious. Under 15‰ and 20‰ salinity conditions，mitochondrial rich cells were dominated by type Ⅰ，with the change of salinity，the apical crypts gradually deepened，and the number of mitochondria-rich cells increased. The surface of the pavement epithelial cells had small ridges and the fingerprint-like circuit was not obvious. 【Conclusion】When the water osmotic pressure changes，the survival rate and the number distribution and morphology of the cells on the gills of juvenile E. tetradactylum，the histological structure of gill are affected by environment salinity.

Key words： Eleutheronema tetradactylum; salinity; juvenile fish; death rate; gills; histological structure

0 引言

【研究意義】四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）俗稱馬友、牛筍或午魚等，隸屬于鯔形目（Mngiliformes）馬鲅科（Polynemidae）四指馬鲅屬（Eleutheronema）。四指馬鲅主要分布在印度洋至西太平洋，尤其在波斯灣至巴布亞新幾內亞、澳大利亞北部和東亞（日本、中國和越南）沿海多有分布（Ballagh et al.，2012;Wang et al.，2014），因其肉質鮮美、生長迅速、抗病性強而受到廣大消費者青睞，已發展成為近年來水產養殖的新品種（區又君等，2018）。水體鹽度是魚類生存的重要環境影響因子之一。魚類通過自身調節來維持體內外滲透濃度的平衡，對水環境變化的適應能力取決于其自身的滲透調節能力（于娜等，2012）。四指馬鲅適應鹽度范圍廣，當水體滲透壓發生改變時，機體自身會產生一系列應激反應以適應環境變化，當鹽度超出其耐受能力時會引起機體死亡，從而導致養殖業生產力下降。魚類的鰓組織不僅是主要的呼吸器官，還參與滲透壓調節、離子平衡及體液pH調節等，在鹽度適應過程中發揮至關重要的作用（侯俊利等，2006;陳世喜等，2017;龔仕玲等，2019）。因此，加強四指馬鲅幼魚鰓組織對鹽度適應性的研究，了解其組織結構的變化機制，對促進四指馬鲅養殖業的健康高效發展具有重要意義。【前人研究進展】近年來，國內外從諸多方面對四指馬鲅進行了研究，主要包括胚胎發育觀察（謝木嬌等，2016）、親魚初次性成熟和苗種規模化繁育技術（區又君等，2017）、DNA條形碼分析及SCAR分子標記開發（楊翌聰等，2019）、光周期對其視網膜結構和視蛋白表達的影響（周慧等，2019）、群體遺傳及其多樣性（Ismail et al.，2019）、精巢發育及精子發生（藍軍南等，2020）及室內循環水和池塘養殖體質量與形態性狀的相關性（李俊偉等，2020）。關于四指馬鲅鰓組織的研究也有少許報道，羅海忠等（2015）研究發現，水體鹽度高于等滲點時，隨著水體鹽度增加，四指馬鲅幼魚鰓絲Na+/K+-ATP酶活性也逐漸增加，表明四指馬鲅幼魚在高鹽度水體中需消耗較多的能量以維持滲透壓平衡;區又君等（2018）在研究急性低溫脅迫對鰓組織結構的影響時發現，隨著低溫處理時間的延長，線粒體豐富細胞數目增多，鰓小片末端輕微膨大至鰓小片整體水腫且嚴重彎曲，表明鰓細胞的損傷程度均隨水溫降低而增強。關于運輸脅迫對鰓組織結構的影響，劉奇奇等（2017）研究表明，未加入抗應激劑的幼魚鰓小片腫脹，部分鰓小片脹破，線粒體豐富細胞體積變大且數量增多，表明運輸脅迫破壞了四指馬鲅鰓的滲透壓調節功能。上述研究結果為本研究的順利開展提供了前期基礎。【本研究切入點】對于水體鹽度變化，不同魚類均有其特定的適應機制，在一定鹽度變化范圍內魚類能正常生存，當鹽度變化超過魚類的適應能力，便會產生應激脅迫，嚴重時甚至導致死亡（林先智等，2015a;施永海等，2015;王雯等，2016a）。此外，當水體滲透壓發生改變時，魚類為適應鹽度變化，其鰓組織結構及鰓小片上細胞的數量和形態均發生顯著變化（區又君等，2013;劉娟娟等，2015）。目前，關于鹽度對四指馬鲅鰓組織形態變化影響的研究相對較少（羅海忠等，2015）。【擬解決的關鍵問題】通過組織石蠟切片及掃描電鏡技術，觀察不同鹽度下四指馬鲅幼魚鰓組織適應性的變化特征，為四指馬鲅苗種生產提供有效的技術支持和理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗所用四指馬鲅幼魚為本課題組在珠海試驗基地培育獲得，平均全長3.11±0.53 cm，平均體重0.224±0.014 g。試驗開始前在室內暫養7 d，暫養鹽度（10.0±0.5）‰，水溫（27±2）℃，期間每天換水1次，每次換水量1/3，24 h連續充氣增氧。暫養結束后，隨機挑選體色正常、體格均勻健壯、活力強的個體共300尾魚進行后續試驗。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 試驗設計 試驗共設0、5‰、10‰（對照）、15‰和20‰等5個鹽度組，每個鹽度組設3個平行。以曝氣自來水或海水晶調節鹽度，將暫養于鹽度為10‰水體中的四指馬鲅幼魚直接放入鹽度為0、5‰、15‰和20‰的水體中，每個平行組20尾魚。試驗期間水溫控制在26～28 ℃，連續24 h充氧，每天換水1次，每次換1/3，調節鹽度，誤差不超過0.5‰。每天9：00和17：00各投喂1次，喂食1 h后將殘餌及糞便用虹吸法吸出。試驗時間持續15 d。

1. 2. 2 樣品采集與處理 在試驗第15 d時，從各鹽度組中隨機選取3尾魚，活體取魚鰓組織，將鰓組織剪成小塊分別置于4%多聚甲醛溶液和電鏡固定液（Servicebio G1102）中固定備用。

鰓組織切片制作：將固定好的樣品以流水沖洗12 h，用50%～100%梯度的乙醇進行脫水（50%乙醇2 h、70%乙醇4 h、80%乙醇2 h、85%乙醇2 h、95%乙醇45 min×2次、100%乙醇45 min×2次），用二甲苯進行透明（1/2無水乙醇+1/2二甲苯的混合液1 h、二甲苯15 min×2次），浸蠟（石蠟2 h×2次），用石蠟進行包埋，切片，采用蘇木精—伊紅（HE）進行染色，中性樹脂封片。

掃描電鏡樣品制備：將固定好的樣品用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3次（每次15 min）。1%鋨酸·0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）室溫（20 ℃）固定1～2 h。0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min。依次放入50%→70%→80%→90%→95%→100%→100%酒精進行脫水，每次15 min。將樣本緊貼于導電碳膜雙面膠上放入離子濺射儀樣品臺上噴金30 s左右進行樣本導電處理。將樣本放入臨界點干燥儀（QUORUM K850）內進行干燥。干燥完畢后在掃描電子顯微鏡（HITACHI SU8010）下觀察，采集圖像分析。

2 結果與分析

2. 1 不同鹽度條件下四指馬鲅幼魚的死亡率

將暫養于10‰鹽度條件下的四指馬鲅幼魚直接放入鹽度為0、5‰、15‰和20‰的水體中。5‰、15‰和20‰組幼魚剛開始集中于水底，靜止不動，5 min后開始沿著水箱壁游動，之后行為逐漸恢復正常。鹽度為0時，幼魚剛開始集群伏于水底，之后在水箱中無方向竄動，出現狂游現象，且游動時身體側翻，無法維持平衡，隨后幼魚的游泳速度逐漸變得緩慢，活動減弱，對外界刺激的反應減弱，12 h內全部死亡。試驗期間，0鹽度組幼魚死亡率為100.0%，5‰組幼魚死亡率為6.6%，對照組幼魚均無死亡，15‰和20‰組幼魚死亡率分別為33.3%和60.0%（表1）。

2. 2 不同鹽度條件下四指馬鲅幼魚鰓組織顯微結構的變化

圖1和表2分別為不同鹽度條件下四指馬鲅幼魚鰓組織顯微結構及鰓小片的變化。5‰鹽度條件下，鰓絲上的鰓小片為扁平囊狀，排列緊密，幾乎平行;與10‰對照組相比，鰓小片變窄變長且間距增寬;鰓小片外側有扁平上皮細胞，呈長條狀分布，鰓小片上的柱細胞呈X形或長梭形;線粒體豐富細胞主要分布在鰓小片基部，呈橢圓狀，著色較淺，呈淡紅色且數量少（圖1-a）。10‰鹽度條件下，鰓絲發達，排列緊密;鰓小片平行緊密排列，鰓小片上細胞飽滿，細胞間無明顯間隙;鰓組織結構無明顯變化，柱細胞主要為X形或圓柱形;線粒體豐富細胞的分布、結構及數量變化均不明顯，主要位于鰓小片基部，體積較小，細胞飽滿，排列緊密，細胞核為藍紫色，細胞質著色淺（圖1-b）。15‰鹽度條件下，鰓小片寬而短，且彼此的間隔較對照組窄，排列在鰓絲兩側;鰓小片上皮增厚，扁平上皮細胞呈鱗片狀，與線粒體豐富細胞相鄰，扁平細胞體積變大，呈長梭形，柱細胞為圓柱形;鰓小片基部的線粒體豐富細胞數量增加，但不明顯;鰓小片上出現一些線粒體豐富細胞，胞體變大，主要呈長柱形或卵圓形，且著色深（圖1-c）。20‰鹽度條件下，鰓小片明顯縮短，且彼此間隔變窄，甚至出現萎縮，尖端略膨大;柱細胞呈長梭形和橢圓形;幼魚的鰓絲和鰓小片上線粒體豐富細胞數量顯著增加，細胞明顯增大，并逐漸向相鄰的鰓小片擴散，兩鰓小片間幾乎全部被線粒體豐富細胞占據;此外，與鰓小片基部與線粒體豐富細胞緊密相鄰的扁平上皮細胞呈三角形，并呈現出不同程度的脫落或分離現象（圖1-d）。

2. 3 不同鹽度條件下四指馬鲅幼魚鰓組織微細的結構變化

圖2為不同鹽度條件下四指馬鲅幼魚鰓細微結構的變化。5‰鹽度條件下，扁平上皮細胞呈多邊形，排列緊密，表面密布微嵴，形成指紋狀回路（圖2-a）;鰓線粒體豐富細胞通過頂膜表面與外界環境相連，位于扁平上皮細胞邊緣;線粒體豐富細胞出現2種類型，即頂膜稍向外凸、開口較大且表面有大量微絨毛和頂膜向內凹陷、開口較小且表面沒有微絨毛;根據其頂模結構可將其分為Ⅰ型（頂膜向內凹陷）（圖2-b）和Ⅱ型（頂膜向外凸起）（圖2-c），其中Ⅱ型線粒體豐富細胞數量較多。10‰鹽度條件下，扁平上皮細胞表面的環狀微嵴形態不規則，且細胞間的界限分布不明顯（圖2-d）;相鄰扁平上皮細胞間的開孔為線粒體豐富細胞的頂膜結構，僅分布在鰓絲鰓小片的基部，鰓小片上未發現有線粒體豐富細胞分布，對照組鰓線粒體豐富細胞的頂膜開口以Ⅰ型為主（圖2-e）。15‰鹽度條件下，扁平上皮細胞表面環狀微嵴變少，邊緣微嵴隆起幅度小，指紋狀回路不明顯（圖2-f）;鰓線粒體豐富細胞的頂膜向內深陷形成頂隱窩，開口較小，且其表面無微絨毛;此鹽度組僅出現線粒體豐富細胞Ⅰ型頂膜開口，未觀察到線粒體豐富細胞Ⅱ型頂膜開口（圖2-g）。20‰鹽度條件下，扁平上皮細胞排列密集，形態與15‰鹽度組相似，且其表面微嵴隆起幅度逐漸變小（圖2-h）;與15‰鹽度組相同，20‰鹽度組也未發現粒體豐富細胞頂膜Ⅱ型開口，而Ⅰ型鰓線粒體豐富細胞的頂隱窩較15‰鹽度組加深，數量增多（圖2-i）。

3 討論

3. 1 鹽度對四指馬鲅幼魚存活率的影響

廣鹽性魚類雖然對鹽度有較強的適應能力，但在面對鹽度脅迫時，仍需消耗大量能量以維持體內的滲透壓平衡，鹽度變化一旦超過其耐受能力范圍，體內滲透壓則無法恒定，最終導致組織器官受損及功能喪失，而影響其存活（林先智等，2015b;王雯等，2016a）。四指馬鲅為典型的廣鹽性魚類，本研究中將對照組10‰鹽度條件下的四指馬鲅幼魚直接放入不同鹽度環境中，試驗開始階段因鹽度的急劇變化，造成各鹽度組幼魚不同程度的死亡，其中0鹽度組幼魚全部死亡，其余各組存活的試驗魚通過調節自身滲透壓，逐漸適應鹽度變化，進而存活率趨于穩定。結果顯示，5‰和10‰鹽度組四指馬鲅幼魚的存活率高于15‰和20‰鹽度組，表明與高鹽環境相比，四指馬鲅幼魚更能適應低鹽環境，且不能在急性淡水脅迫條件下存活，與羅海忠等（2015）的研究結果一致。

3. 2 鹽度對四指馬鲅幼魚鰓組織結構的影響

對大多數水生動物來說，鰓組織不僅是主要的呼吸器官，還在維持機體內外的滲透壓平衡中發揮至關重要的作用。當水體鹽度發生變化時，魚類的鰓組織結構為適應環境也會發生相應變化（楊建等，2014）。本研究結果表明，與對照組10‰相比，生活在5‰低鹽度水體中的幼魚，其鰓小片變細變長，向外延伸，且間距增寬，與水體的接觸面加大，通過攝取水環境中的無機離子以便于能在低滲環境中生存;15‰和20‰鹽度組的試驗魚，其鰓小片變寬變短，間距變窄，鰓小片上有線粒體豐富細胞，線粒體豐富細胞通過主動運輸來加強水氧的交換量，使其能更好地適應高鹽環境。扁平上皮細胞是鰓組織結構的主要組成部分，主要以被動運輸方式參與鰓的生理功能，其表面的微脊能進一步增加鰓組織與水體的接觸面，起增強氣體交換的作用（于娜等，2012;區又君等，2013）。本研究中，各鹽度組幼魚鰓小片遠端的扁平上皮細胞變化差異相對較小，扁平上皮細胞主要呈鱗片狀，細胞核變長;而在鰓小片基部的扁平上皮細胞的形態變化差異相對明顯，隨著水體鹽度的增加，與線粒體豐富細胞相鄰的扁平上皮細胞體積變大，形似長梭形或三角形，同時出現不同程度的脫落或分離現象（于娜等，2012;區又君等，2013）。這與前人對鯔（Mugil cephalus）及中華鱘（Acipenser sinensis）子二代幼魚的研究結果相似（于娜等，2012;劉娟娟等，2015），表明在不同鹽度脅迫條件下，四指馬鲅幼魚鰓組織結構發生了適應性變化。

3. 3 鹽度對四指馬鲅幼魚線粒體豐富細胞的影響

魚類鰓組織的線粒體豐富細胞主要負責離子的攝取和分泌（Inokuchi and Kaneko，2012;Yada et al.，2012;Kang et al.，2013;Kokou et al.，2019）。線粒體豐富細胞不僅能在低滲環境中吸收Cl-進行調節，還能在高滲環境中通過分泌Na+和Cl-完成自身調節（莊青青等，2012）。線粒體豐富細胞主要分布在鰓小葉的基部，其頂端小窩開口于鰓的表面，與外界環境直接接觸。線粒體豐富細胞在鰓上皮中所占比例雖然不高，但在進行物質交換的過程中發揮著主動運輸功能（于娜等，2012）。本研究結果顯示，四指馬鲅幼魚存在2種線粒體豐富細胞，根據頂膜結構將其分為Ⅰ型（頂膜向內凹陷）和Ⅱ型（頂膜向外凸起）;低鹽條件下的四指馬鲅幼魚，其鰓線粒體豐富細胞主要為Ⅱ型，細胞數量少，胞體小;高鹽條件下四指馬鲅幼魚Ⅰ型線粒體豐富細胞分布在鰓小片基部的數量增加，并逐漸向相鄰的鰓小片中間不斷擴散。這與區又君等（2014）對遮目魚（Chanos chanos）、王雯等（2016b）對斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）的研究結果相似。區又君等（2013）在對卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）的研究中發現，低鹽條件下卵形鯧鲹鰓組織上的線粒體豐富細胞主要為Ⅱ型，無明顯的泌氯功能，且代謝水平低，其主要通過離子交換來吸收水體中的無機鹽及進行自身pH調節以維持體內外滲透壓平衡。隨著鹽度增加，鰓上線粒體豐富細胞呈現出Ⅰ型結構，集中分布于鰓小片的基部，且向相鄰的鰓小片擴散，其泌氯功能與代謝水平均較高，表明線粒豐富細胞在滲透壓調節上發揮著非常重要的作用。線粒體豐富細胞結構及功能的適應性變化規律，是大多數廣鹽性魚類能適應復雜多變的水體鹽度的主要原因之一。

4 結論

當水體滲透壓改變時，四指馬鲅幼魚存活率及鰓小片上細胞的數量分布和形態均發生顯著變化，鰓組織的結構變化特征與其所處的環境鹽度有關。

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（責任編輯 王 暉）