貴腐菌的篩選鑒定及培養條件優化

王超萍，劉凡啟，嚴戰偉，尹向田*，丁燕*

（1.山東省葡萄研究院/山東省葡萄栽培與精深加工工程技術研究中心，山東濟南 250100；2.山東新豐農業開發股份有限公司，山東威海 264500；3.北京張裕愛斐堡國際酒莊有限公司，北京 101500）

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），屬半知菌綱，叢梗孢目，叢梗孢科，葡萄孢屬，是產生貴腐作用的病原菌[1]。該菌的寄生范圍比較廣[2]，可以侵染200多種植物的不同組織，對農業生產有較大危害[3-4]。在葡萄貯存中，灰葡萄孢菌繁殖速率快，變異率高，適應性強[5]，造成的損失最為嚴重[6]。2013年10月，美國加州大學金海翎教授發現灰霉菌是世界上首個可以利用小分子RNA達到有效侵染的病原菌，由此開啟了一個新的研究方向[7]。

葡萄果實成熟期間，在夜間迷霧濕度大而白天晴朗干燥的干濕交替條件下，貴腐菌才能對葡萄果實發生適度侵染，導致果實在樹體上天然濃縮。貴腐菌在侵染過程中改變了葡萄的新陳代謝，刺激果實產生一些次生代謝產物，進一步豐富了葡萄的風味物質，使釀成的貴腐酒有別于其他甜葡萄酒，具有獨特的風味。

乳山位于山東半島東南部，地處北緯36°41′～37°08′，東經121°11′～121°51′，屬暖溫帶東亞季風型大陸性氣候，四季變化和季風進退較明顯。但與同緯度的內陸相比，具有氣候溫和、雨水豐沛、光照充足、無霜期長的特點。該地以砂質壤土為主，透氣性好，排水容易，極有利于葡萄生長。獨特的小氣候造就了乳山葡萄酒特有的產區風格，也為貴腐菌的侵染提供了可能。

由于氣候條件對天然貴腐作用的發生起著關鍵影響，除了歐洲傳統的優質貴腐酒產區外，世界上其他釀酒葡萄產區很難在自然條件下使葡萄發生貴腐作用，因此貴腐酒非常珍貴，目前國內沒有批量生產。

Caseys等[8]為了揭示灰葡萄孢的寄主特異性和致病性的遺傳結構，對灰葡萄孢在整個植物界的侵染結果進行分析，從8種寄主植物的90種基因型上，生成98株灰霉病菌的傳染性矩陣，結果表明主要是由寄主抗性或病原體毒力的變化所解釋。蘭圓圓等[1]利用從感染灰霉菌的番茄果實、青菜豆果實和葉子上分離得到了灰葡萄孢菌，并成功進行了人工侵染得到貴腐葡萄；安榮艷等[9]報道‘霞多麗’貴腐酒研究采用的菌種選自感染了灰霉病的果蔬染病組織，通過不同條件下灰葡萄孢菌種的β-葡萄糖苷酶酶活的測定與比較，最終選定編號為Botrytis-T的菌株作為人工貴腐葡萄的侵染使用菌株；汪蕾等[10]在賀蘭山東麓貴腐葡萄特征研究中，從‘威代爾’葡萄上分離得到菌株，經過光學顯微鏡觀察灰葡萄孢為表層侵染，確定其是造成感染的微生物；黃露莉等[11]研究的人工貴腐‘玫瑰蜜’葡萄酒采用的菌種是從‘夏黑’葡萄果實上分離得到，經形態學和分子鑒定為灰葡萄孢。此外，也有研究人員對灰葡萄孢在不同條件下的生長情況進行對比分析，楊玉紅等[12]調查了不同碳源、pH、光照、溫度條件對菌種的影響，得出灰霉菌在以下條件生長發育較快：馬鈴薯＋葡萄糖培養基，pH5～6、18～26 ℃，每天給予8 h的光照。李寧等[13]探索了在搖瓶液體培養條件下，不同碳源、氮源和無機鹽對灰葡萄孢液體深層培養的影響，確定了最佳培養基組成為葡萄糖3%、土豆汁4%、硝酸鉀0.1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%；最佳培養條件為溫度26 ℃、pH 5.5、轉速120 r/min。在乳山田間試驗觀察到晚收的釀酒葡萄‘貴人香’果實表面前期為黑褐色，呈皺縮甚至干癟狀態，但果肉完好未腐爛，表現出典型的“貴腐”特征，因此采樣作為研究對象進行篩菌鑒定，并研究菌株的最佳培養條件。該研究將為中國貴腐酒的研制及其菌種分子生物學研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳山臺依湖酒莊10月底11月初的晚摘感染貴腐病害的釀酒葡萄‘貴人香’。

培養基有PDA培養基、PSA培養基、葡萄汁瓊脂培養基（自制）、葡萄枝條瓊脂培養基（自制）、MEA麥芽汁瓊脂培養基、PDA改良培養基（1/2PDA＋1/2MEA）；主要試劑為葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、麥芽糖、牛肉膏、酵母粉、酵母膏、麥芽浸膏、尿素、胰蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、硝酸鈉。以上培養基、試劑均購自濟南賽傲生物技術有限公司。真菌基因組DNA提取試劑盒：Omega，D3390；DNA純化回收試劑盒：購自天根生化科技（北京）有限公司，DP214；引物：由生工生物工程股份有限公司合成，按照合成單加入ddH2O，制成10 μmol溶液。

1.2 主要儀器與設備

無菌打孔器：購自濟南賽傲生物技術有限公司；光學顯微鏡：意大利Optika；菌種分離超凈臺：蘇凈安泰。

1.2 方法

1.2.1 貴腐菌的篩選

采用常規組織分離方法[11]。選取感染貴腐菌病的釀酒葡萄‘貴人香’，用無菌挑針選取葡萄表皮感染貴腐菌的病健交接組織，大小約為3 mm×3 mm，用75%的酒精消毒30 s，再用無菌水沖洗3次，用無菌鑷子將挑取的組織置于PDA培養基上，鋪平，27 ℃下培養3～5 d。從分離的菌落中挑選具有典型性狀的無雜菌菌落重新接種到PDA平板上。相同溫度條件下，繼續培養3～5 d。如此反復，直至菌落形態一致時保留分離出的菌株，并將其保存在PDA培養基中。

1.2.2 貴腐菌的鑒定

菌落形態學觀察：將純化好的菌種選取3株，取單菌落接種至改良PDA[14]培養基上，于27 ℃下培養3 d，觀察單菌落、菌絲形態、生長速度、顏色等特征變化，使用十字交叉法測定并記錄菌落直徑大小。

菌絲及孢子形態學觀察：在400倍顯微鏡下觀察菌株分生孢子形態。

貴腐菌的分子生物學鑒定[15]：使用真菌DNA小量提取試劑盒D3390提取DNA，用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'進行PCR擴增，PCR產物使用普通瓊脂糖凝膠DNA試劑盒回收。產物委托青島派森諾基因科技有限公司進行測序，將得到的ITS rDNA序列用NCBI Blast程序與NCBI ribosomal RNA sequence數據庫中的數據進行比對，利用MEGA 4.0軟件繪制系統發育樹[16]。

1.2.3 貴腐菌培養基的選擇

培養基的選擇：選用PDA培養基、PSA培養基、葡萄汁瓊脂培養基、葡萄枝條瓊脂培養基、MEA麥芽汁瓊脂培養基、PDA改良培養基（1/2PDA＋1/2MEA）進行對比試驗。使用打孔器在供試菌落邊緣打取菌餅[17]，然后將菌餅用挑針轉接到6種不同的培養基上，在27 ℃條件下培養3 d，使用十字交叉法測定并記錄菌落大小，3次重復。

碳源的選擇：以改良的PDA為基礎培養基，分別選用1%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、麥芽糖、果糖代替PDA培養基中的碳源，其他操作同培養基篩選，3次重復。

氮源的選擇：以改良的PDA為基礎培養基，分別選用1%的牛肉膏、酵母粉、酵母膏、麥芽浸膏、尿素、胰蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、硝酸鈉代替PDA培養基中的氮源，其他操作同培養基篩選，3次重復。

pH選擇：以改良PDA為基礎培養基，用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH調整pH，梯度分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11。制成不同的pH梯度的平板分別接菌，其他操作同培養基篩選，3次重復。

溫度的選擇：以改良PDA為基礎培養基，分別在4、10、15、20、25、30、35 ℃下進行培養，其他操作同培養基，3次重復。

光照的選擇：在25 ℃條件，改良的PDA為基礎培養基，3個菌株在無光照、光照、光照及無光照時間各半的情況下培養，其他操作同培養基篩選，3次重復。

2 結果與分析

2.1 菌種的形態分析

2.1.1 灰葡萄孢的形態學鑒定

試驗共分離到68株菌，選取3株疑似貴腐菌株的菌落進行培養。初期菌落灰白色，周圍光滑、規則，后期菌絲變成鼠灰色，第7天孢子開始發芽，菌絲密集，氣生菌絲發達，基內菌絲結成團，3～4 d后開始產生孢子。孢子頭密布，邊緣處密度較大，培養10 d開始形成菌核。菌核緊密貼生在培養基表面，圓盤形，灰黑色，大小為7 mm。在光學顯微鏡下觀察到的菌株孢子形態如圖1、圖2、圖3，孢子梗叢生，有隔膜，孢子呈球形或者橢圓形，單胞，通過對比《真菌鑒定手冊》[18]，初步鑒定為灰葡萄孢。

圖1 菌株1菌落及孢子形態Figure 1 Colony and spore morphology of strain 1

圖2 菌株2菌落及孢子形態Figure 2 Colony and spore morphology of strain 2

圖3 菌株3菌落及孢子形態Figure 3 Colony and spore morphology of strain 3

2.2 貴腐菌的分子生物學鑒定

利用通用引物ITS1/ITS4對菌株1、菌株2、菌株3的ITS rDNA片段進行擴增，經測序獲得目的基因片段分別為526 bp、503 bp、510 bp，經Blast搜索并與GenBank數據庫中的核酸序列進行同源性比較，建立系統發育樹。發現3株菌株均與灰葡萄孢的基因序列同源性相近，同源率在99.23%以上。挑選親緣性較高的同屬不同種的菌株作為參比菌株，并采用最大似然法（maximum likelihood analysis）用MEGA 4.0構建系統發育樹。結果表明，菌株1、菌株2、菌株3分別與參比菌株B.cinereaZ17 KC172064.1、B.cinereaLW6 MN077161.1、B.cinereaQ1 MT704983.1同源性相近。結合形態特征鑒定結果，可將3株菌鑒定為B.cinerea，分別命名為GRX06、GRX08、GRX62（圖4）。

圖4 基于ITS rDNA序列構建的貴腐菌和相關真菌的系統發育樹Figure 4 Phylogenetic tree of B.cinerea and related fungi based on ITS rDNA sequence

2.3 菌種培養基的選擇及培養條件的優化

2.3.1 培養基及其成分的選擇

（1）基本培養基的選擇。通過對3個菌株在6種不同培養基上的生長表現，根據3 d后菌落直徑測量結果及柱狀圖（圖5）可以發現，3株菌株在所選培養基上均可生長，但在PDA改良培養基上的生長情況最佳，菌落直徑分別為6.78 cm、6.95 cm、7.06 cm。

圖5 不同培養基對3株菌株生長情況的影響Figure 5 Effect of different culture media on three strains growth

（2）碳源的選擇。通過對3株菌株在6種不同碳源的改良PDA培養基上進行培養，根據菌落直徑的測量可以發現，3株菌株均能很好的利用這6種碳源，但對碳源優劣次序不同。GRX62的最佳碳源為甘露醇，菌落直徑5.13 cm；GRX06的最佳碳源為葡萄糖，菌落直徑4.47 cm；GRX08的最佳碳源為甘露醇，菌落直徑4.22 cm（圖6）。

圖6 碳源對3株菌株生長情況的影響Figure 6 Effect of carbon sources on strains growth

（3）氮源的選擇。通過對3個菌株在9種不同氮源的PDA改良培養基上進行培養，根據菌落直徑可以發現，3株菌株在以尿素為氮源的培養基上幾乎不生長，在其他氮源培養基上菌體生長正常，而且3株菌株的氮源優劣次序不同。GRX62最佳氮源為酵母粉，菌落直徑為6.48 cm；GRX06的最佳氮源為牛肉膏，菌落直徑為6.47 cm；GRX08的最佳氮源為硝酸鉀，菌落直徑6.35 cm（圖7）。

圖7 不同氮源對3株菌株生長情況的影響Figure 7 Effect of nitrogen sources on growth of three strains

（4）pH值優化。通過對3個菌株在9種不同pH培養基的培養，根據菌落直徑的測量數據發現（圖8），3株菌株在偏中性的培養基上均生長良好。GRX62和GRX08在不同的pH下均能生長，GRX06在pH為3、4的情況下基本不生長。GRX62的最佳pH為8，菌落直徑為6.70 cm；GRX06的最佳pH為6，菌落直徑為7.15 cm；GRX08的最佳pH為6，菌落直徑為6.55 cm。

圖8 不同pH對3株菌株生長情況的影響Figure 8 Effect of different pH on growth of three strains

2.3.2 培養條件的選擇

（1）溫度條件優化。對3菌株在7個溫度處理下進行培養，根據培養基菌落直徑的測量數據可以發現，溫度低于4 ℃及高于35 ℃時，菌落幾乎不生長。GRX62在溫度為20 ℃時，菌落直徑最大為6.47 cm；GRX62在25 ℃時，菌落直徑最大為7.15 cm；GRX08在溫度為25 ℃時，菌落直徑最大為6.55 cm（圖9）。

圖9 不同溫度對3株菌株生長情況的影響Figure 9 Effect of temperatures on growth of three strains

（2）光照條件優化。對3菌株在3種不同光照條件下進行培養，根據培養基菌落直徑的測量數據可以發現，菌落大小變化不大，GRX62和GRX06的最佳光照時間均為全光照，菌落直徑分別為6.47、6.15 cm；GRX08菌株在黑暗的條件下長得最好，菌落直徑是5.91 cm（圖10）。

圖10 不同光照處理對3株菌株生長情況的影響Figure 10 Effect of illumination treatment on growth of three strains

3 討論與結論

從乳山臺依湖酒莊的疑似發生貴腐作用的晚收釀酒葡萄‘貴人香’上分離篩選出3株貴腐菌GRX62、GRX06、GRX08。通過形態學、生理生化及ITS rDNA鑒定，確定3株菌株均為貴腐菌（Botrytis cinerea）。試驗結果表明，GRX62的最佳培養條件為：改良PDA培養基、碳源為甘露醇、氮源為酵母粉、pH為8、溫度為20 ℃，光照時間72 h；GRX06的最佳培養條件為：改良PDA培養基、碳源為葡萄糖、氮源為牛肉膏、pH為6、溫度為25 ℃，全光照；GRX08的最佳培養條件為：改良PDA培養基、碳源為甘露醇、氮源為硝酸鉀、pH為6、溫度為25 ℃，暗培養。試驗中選出的培養基基本與金其榮[19]等研究得出的結論一樣，均為改良PDA培養基。

試驗中貴腐菌的生長溫度及光照條件，與雷百戰、張鵬等[20-21]的研究結果一致；最適pH值也與李廷剛等[22]的結果相同。對貴腐菌的生長條件進行探索，不僅有利于認識貴腐菌的生物學特性和發生特點，在與土壤碳、氮等利用關系方面也有重要意義[23]。

山東是中國葡萄酒產業基礎最好的地區，擁有張裕、威龍、煙臺長城等一線品牌和蓬萊、乳山酒莊集群等，也是中國葡萄酒產業發展的風向標。試驗首次從臺依湖酒莊的晚收‘貴人香’葡萄中篩選出可以釀造貴腐酒的菌種，將為葡萄貴腐菌的分子生物學研究提供基礎材料，為推動膠東地區葡萄酒產業的健康發展，豐富葡萄酒產品類型有重要意義。