青蒿琥酯調節BCL?2家族蛋白平衡誘發肌成纖維細胞凋亡

曾高淳 吳苗 曾令基 王雅文 羅瓊 賴沛龍 杜欣 翁建宇

1華南理工大學醫學院（廣州510006）；2廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）血液內科（廣州510080）

閉塞性細支氣管炎（bronchiolitis obliterans，BO）是異基因造血干細胞移植后的嚴重晚期并發癥，以小氣道纖維化為主要病理機制，現有治療方法效果不佳，患者5年病死率達50%，仍需探索新的治療策略［1-3］。

肌成纖維細胞（myofibroblasts，MFB）是纖維化的核心效應細胞，MFB 凋亡逃逸是纖維化發生發展的重要機制，與BCL?2 家族失衡密切相關［4］，近年來研究［5］表明靶向BCL?2 失衡表達誘導MFB 凋亡，可逆轉已形成的皮膚纖維化，因此靶向MFB 凋亡可能是改善BO 的新治療策略。

青蒿琥酯（artesunate，ART）抑制多種器官纖維化［6］。王昌明等［7-11］證實：ART 可通過誘導人肺成纖維細胞（fibroblasts，FB）凋亡、抑制FB 分泌功能、抑制FB 向MFB 轉化，發揮抗肺纖維化作用。FB 是MFB 眾多來源之一，調控纖維化核心細胞——MFB 凋亡可能是遏制和逆轉纖維化的更高效靶點。ART 通過調控BCL?2 家族平衡誘導FB 及多種腫瘤細胞凋亡［7，12-14］，筆者前期發現ART 可以減輕小鼠BO 病理損傷［15］，但其對MFB 的作用及機制鮮有報道。本研究就ART 能否直接誘導MFB 細胞凋亡及其可能的相關機制展開研究和探索，以期為ART 治療BO 提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞來源正常人胚肺成纖維細胞系MRC?5（ATCC 公司）。

1.1.2 主要試劑α?MEM 培養基、胰酶、胎牛血清（美國Gibco 公司），TGF?β1（美國PeproTech 公司），青蒿琥酯（美國Sigma 公司），細胞增殖及毒性檢測（CCK?8）、AnnexinV?AF647/PI（上海奕杉生物公司），JC?1 線粒體膜電位熒光探針（上海翊圣生物公司），逆轉錄及RT?qPCR 試劑盒（湖南艾科瑞生物公司），兔抗人α?SMA、兔抗人GAPDH 和HRP 標記的羊抗兔IgG（英國Abcam 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建MFB 模型取10～12 代FB 細胞，以2× 104/孔接種于六孔板各孔中，分別加入0、2.5、5、10、20、40 ng/mL TGF?β誘導48 h，根據α?SMA 的表達水平選擇最佳濃度進行MFB 模型構建。

1.2.2 ART濃度探索CCK?8法檢測細胞活性：將FB細胞以5×103/孔接種于96孔板中，加入TGF?β誘導48 h，然后于各孔分別加入0、50、100、200 μmol/L ART 處理24 h，更換含10% CCK?8 的培養基，同時加設空白組，于培養箱中孵育1 h，測定450 nm 吸光度，根據半數抑制濃度（IC50）選擇ART 濃度進行后續實驗。

1.2.3 實驗分組及流程（1）MFB 組：不加ART 的對照組；（2）MFB?ART組：加入100 μmol/L ART處理24 h，見圖1。每組設計3 個復孔，后續各檢測指標均復測3 次。

圖1 實驗流程Fig.1 Experimental procedure

1.3 檢測指標

1.3.1 RT?qPCR檢測α?SMA及BCL?2家族基因用TRIzol 法提取MFB 組和MFB?ART 組細胞的總RNA，按照說明書合成cDNA 并構建20 μL RT?qP?CR 反應體系和實驗。引物序列見表1，以2?ΔΔCt計算各基因的相對表達水平。

1.3.2 Western blot檢測α?SMA的蛋白表達情況提取細胞蛋白，進行定量和變性，取20 μg 上樣，電泳90 min，電轉2 h，室溫封閉1 h，TBST 洗膜三次，以GAPDH 抗體作為對照，加入α?SMA 抗體于4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜三次，加入二抗于室溫下孵育1 h，TBST 洗膜三次，加入顯色液進行曝光，使用Image J 軟件對條帶進行灰度值分析，計算α?SMA/GAPDH 比值。

1.3.3 JC?1檢測細胞線粒體膜電位變化情況（1）熒光顯微鏡觀察：細胞JC?1 染液孵育20 min，PBS清洗后，鏡下觀察。（2）酶標儀檢測：將FB 細胞以5 × 103/孔接種于96 孔板中，加入TGF?β誘導48 h形成MFB 細胞，按照1.2.3 進行分組，分別于0、24、36、48、60、72、84、96 h 進行JC?1 染液孵育，同時設置相應陰性及陽性對照組，酶標儀檢測綠色（波長510/529 nm）和紅色熒光（波長577/595 nm）數值，并計算最終熒光數值。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡情況將FB 細胞以1×104/孔接種于24孔板中，加入TGF?β誘導48 h形成MFB 細胞，按照1.2.3 實驗分組及流程進行分組，消化、離心、PBS 清洗后重懸細胞，進行Annexin V和PI雙染色，室溫避光孵育5 min，立即流式檢測。

1.4 統計學方法應用SPSS 25.0 統計軟件分析數據，計量資料用均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統計學意義。統計結果均采用GraphPad Prism 8 作圖。

2 結果

2.1 MFB細胞模型構建FB細胞加入TGF?β培養48 h 后：細胞形態與FB 組無明顯差異，細胞生長更為密集。見圖2A；α?SMA mRNA和蛋白水平均呈濃度相關性遞增，α?SMA mRNA 在TGF?β 20 ng/mL 達峰，但TGF?β 10、20、40 ng/mL 組之間差異無統計學意義；α?SMA 蛋白在TGF?β 10 ng/mL 達峰，但TGF?β 10、20 ng/mL 組之間差異無統計學意義，見圖2B、C。故此，本研究確定10 ng/mL TGF?β刺激FB 細胞48 h 為MFB 細胞模型的構建體系。

圖2 MFB 模型的構建Fig.2 Construction of the model of MFB

2.2 ART抑制MFB活性實驗CCK?8實驗結果表明：ART 濃度為50、100、200 μmol/L 時，細胞活性呈濃度依賴性降低，分別為（68.33±2.31）%、（48.00 ±3.61）%、（19.33±8.02）%，且較基線和對照組明顯降低（P< 0.001），見圖3。在ART 濃度100 μmol/L 時最接近IC50，因此選擇該濃度進行后續實驗。

2.3 流式檢測ART 對MFB 細胞凋亡情況的影響流式結果表明：MFB 組細胞早期凋亡（Annexin V+PI-）比例為（2.94 ± 0.28）%，晚期凋亡（Annexin V+PI+）比例為（0.51 ± 0.10）%；而MFB?ART 組分別為（13.40 ± 0.87）%和（2.12 ± 0.39）%；MFB?ART組細胞總體凋亡率（15.52 ± 1.23）%高于MFB 組（3.45±0.34）%，見圖4。實驗結果證實：ART 可促進MFB 細胞發生凋亡。

2.4 JC?1 檢測ART 處理后細胞線粒體膜電位變化情況

2.4.1 熒光顯微鏡鏡下可見MFB 組細胞胞質紅綠熒光共存，而MFB?ART 組細胞數量減少，且大部分細胞紅色熒光減弱，胞質中僅有綠色熒光（白色箭頭所示），見圖5A。

圖3 CCK?8 檢測不同濃度ART 對MFB 細胞活性的影響Fig.3 Effects of different concentrations of ART on cell viability of MFB cells by cell counting kit?8 assay

圖4 ART 對MFB 細胞凋亡的影響Fig.4 Effects of ART on the apoptosis of MFB cells

2.4.2 酶標儀（1）MFB 組：細胞紅色和綠色熒光強度在8 個時間點存在一定波動，但組間無顯著變化，見圖5B、C。（2）MFB?ART 組：0 ～ 96 h 紅色熒光強度明顯下降［從（17.58 ± 1.08）降至最低峰（1.28±0.35）］，36、48、60、72 h（P<0.01）和84、96 h（P<0.05）比基線明顯下降，雖然60～96 h 的紅色熒光強度稍有回升，但組間變化無差異。各時間點綠色熒光的強度變化無差異。見圖5B、C。以上結果表明：ART 可降低MFB 細胞線粒體膜電位，其作用高峰出現于ART 處理后24～36 h。

圖5 ART 對MFB 細胞線粒體膜電位的影響Fig.5 Effects of ART on the mitochondrial membrane potential of MFB cells

2.5 RT?qPCR 檢測ART 處理后MFB 線粒體凋亡相關基因的表達情況RT?qPCR 結果表明：相較于MFB 組，MFB?ART 組抗凋亡的BCL?2 表達明顯降低（P< 0.001），而BCL?W、BCL?XL、MCL?1 表達變化差異無統計學意義；具凋亡激活功能的BIM（P< 0.01）表達升高，而BID 表達變化差異無統計學意義；增敏功能的PUMA、BMF、HRK（P<0.05）表達升高，而BAD、NOXA 表達變化差異無統計學意義；效應功能的BAX 和BAK 表達變化差異均無統計學意義，見圖6。

圖6 ART 對MFB 細胞線粒體凋亡相關基因表達的影響Fig.6 Effects of ART on mitochondrial apoptosis related gene expression in MFB cells

3 討論

BO 是異基因造血干細胞移植后肺部慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus host disease，cGVHD）嚴重并發癥，小氣道纖維化是關鍵病理改變［1，16］：氣道上皮損傷引起炎癥、免疫紊亂，進而引起MFB 的活化、增殖、凋亡逃逸，進一步引發細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積，最終導致不可逆性瘢痕形成。cGVHD?BO 目前治療以抗炎、免疫調節為主，但效果不盡人意。貝伐珠單抗［17］、糖皮質激素［18］等可改善肺纖維化及炎癥，但無法克服移植患者排斥、免疫重建不穩定導致的氣道反復損傷和慢性炎癥的體質因素。靶向纖維化細胞因子通路的新藥如“尼達尼布”和“吡非尼酮”在特發性肺纖維化的臨床試驗中療效未達預期，且無法逆轉已形成病理纖維化損傷，探索BO治療新策略極為迫切。

MFB 是纖維化過程中的關鍵效應細胞，高表達α?SMA，正常組織中沒有或極少MFB，但損傷和炎癥刺激可使局部的FB、上皮細胞、內皮細胞、間充質細胞等轉化為MFB，驅使MFB 激活、增殖、分泌、收縮，致使局部組織機械壓力增大、ECM 沉積及促纖維化細胞因子的釋放，加劇纖維化的進程。病理纖維化中MFB 通過凋亡逃逸在組織中持續存活，造成靶器官不可逆損傷［19-21］。靶向MFB凋亡，比靶向復雜的炎癥通路或某一細胞向MFB轉化途徑更具高效性。LAGARES 等［4-5］發現在硬皮病小鼠模型中，MFB 促凋亡激活蛋白BIM 表達升高，伴隨抗凋亡蛋白BCL?XL更高水平表達的現象，導致BCL?2 家族蛋白天平最終向抗凋亡方向傾斜，MFB 發生了凋亡逃逸；利用BCL?2 蛋白家族（BCL?XL、BCL?2、BCL?W）抑制劑ABT?263 可糾正BCL?2 家族蛋白的表達失衡，成功誘導MFB 細胞發生線粒體凋亡，并逆轉皮膚的病理纖維化。另外，二甲雙胍可經AMPK途徑促MFB的凋亡和失活，從而逆轉肺纖維化［22］；異羥肟酸可經下調BCL?XL和上調BAK 誘導特發性肺纖維化患者的MFB 凋亡，并可改善博來霉素誘導的小鼠肺纖維化［23］；過表達基質細胞蛋白CCN5 可激活線粒體凋亡途徑誘導MFB 凋亡并部分逆轉已形成的心臟纖維化［24］等發現，提示啟動MFB 線粒體凋亡的分子基礎取決于BCL?2 家族蛋白中促凋亡/抗凋亡力量組合的天平傾向，因此，靶向MFB 凋亡逃逸——調節MFB的BCL?2 家族蛋白失衡，可能是延緩甚至逆轉纖維化的一種有效策略。

ART 是經典的抗瘧疾藥物，其安全性在眾多臨床研究中已被驗證。近來研究［6］發現：ART 在肺、腎臟、肝臟、皮膚等許多器官中皆可發揮抗纖維化作用，可誘導局部組織細胞凋亡、抑制局部組織細胞向MFB 轉化及其抗炎、免疫調節等。本研究團隊既往工作基礎顯示［15］：ART 可延長cGVHD小鼠的生存時間，改善肺臟、肝臟、皮膚病理損傷，減輕BO 小鼠小氣道損傷和α?SMA+MFB 細胞浸潤，提示ART 可能通過抑制MFB 改善cGVHD?BO病理進程。

本研究通過TGF?β誘導FB 構建MFB 體外模型，證實ART 可調節MFB 的BCL?2 家族抗凋亡（BCL?2↓）/促凋亡（BIM↑、PUMA↑、BMF↑、HRK↑）平衡向促凋亡方向傾斜，觸發MFB 發生線粒體膜去極化，并直接誘導MFB 細胞凋亡。ART 作用于MFB 的線粒體凋亡機制與FB 不同，ART 誘導FB 凋亡（BAX↑、BCL?2↓）［7］，而不能促進MFB 的BAX 表達，說明對于不同細胞，ART 靶向BCL?2 家族中抗凋亡/促凋亡分子的作用機制不同及組合存在差異［25］。

本研究首次證實ART 可直接誘導MFB 凋亡，并且ART 通過調控MFB 的BCL?2 家族平衡傾向，誘導MFB 發生線粒體凋亡，這些結果為ART 治療cGVHD?BO 提供了實驗證據。本研究也存在一些局限性：體外實驗與體內環境存在差異，需進一步完善體內研究；有關ART 調節MFB 線粒體BCL?2家族蛋白失衡的分子機制還有待進一步的研究。筆者將繼續探索ART 調控MFB 的BCL?2 家族蛋白表達分子機制，并通過對cGVHD?BO 小鼠模型和臨床病例的深入研究，確定cGVHD?BO 特異性BCL?2 家族蛋白失衡組合。總的來說，ART 調控MFB 凋亡逃逸可能是其抗纖維化的重要機制之一，對于血液系統腫瘤合并cGVHD 的移植患者，ART 可能是一個具有抗纖維化，又能兼顧抗腫瘤、抗感染作用的潛在候選藥物，有望成為cGVHD?BO 治療的新方法。