Src在舌鱗狀細胞癌組織中的表達及對舌鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用

李軍 陳偉程 徐若竹 湯佳臻

深圳市龍崗區人民醫院口腔科（廣東深圳518100）

口腔癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）為頭頸部最常見的惡性腫瘤［1?2］，5年生存率約為63%，其中舌鱗狀細胞癌（tongue squamous cell car?cinoma，TSCC）最為常見。由于舌部運動以及淋巴回流原因，TSCC 淋巴結轉移率較高［3?4］，從而降低患者的生存率。盡管TSCC的治療已經取得了最新進展，但TSCC 的病死率仍然很高［5?6］。所以有必要對TSCC 進展涉及的分子途徑進行研究，為TSCC新的治療策略提供方向。

Src 酪氨酸激酶（Src tyrosine kinase，Src）是一種非受體酪氨酸激酶，分子量為60 kDa。Src 作為Src 激酶家族的成員，在細胞增殖、侵襲和遷移等方面發揮重要作用［7?9］。研究表明，Src蛋白在多種腫瘤細胞中高度活化，并促進腫瘤的發生發展［10?11］。但Src 蛋白在舌鱗癌中的作用尚未明確，本研究將對Src 蛋白在口腔舌鱗癌中的表達和與臨床病理特征之間的關系以及對舌鱗癌細胞增殖和侵襲遷移能力的影響進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料來源收集2012年2月至2019年2月于我院口腔頜面外科就診的TSCC 患者20 例，其中男12 例，女8 例，年齡33～60 歲。所有病例術前病理活檢均確診為TSCC，術前未行放療或化療。切取TSCC 組織和腫瘤邊界外約1 cm 的癌旁組織進行研究。該研究通過醫院倫理委員會批準，納入研究的患者本人或其家屬均知情同意。

1.2 主要試劑兔抗人Src 單克隆抗體（Cell Sig?naling Technology，美國）；即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒、加強型DAB 顯色試劑盒、中性樹膠（福州邁新生物股份有限公司，中國），EDTA組織抗原修復液（北京中杉金橋生物技術有限公司，中國）；舌鱗癌SCC127 細胞系購自ATCC，DMEM 及胎牛血清（Gibco，美國），基底膜基質BD Matrixgel（354234）（Thermo Fisher，美 國），SRC 的shRNA 載體合成自上海吉瑪制藥技術有限公司，SRC?shRNA 1#：AAACTCCCCTTGCTCATGTACTT，SRC?shRNA 2#：CATCCTCAGGAACCAACAATTC；CCK?8 試劑盒（Dojindo，日本）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化采用S?P 法：（1）10%甲醛溶液固定標本，脫水，石蠟包埋后4 μm 連續切片；（2）65 ℃烤片，2 h，經二甲苯及梯度酒精脫蠟、水化；（3）pH=9.0 的EDTA 組織抗原修復液，高壓修復10 min 后自然冷卻。PBS 洗滌3 次后3%過氧化氫室溫處理10 min，PBS 洗滌3 次，山羊血清封閉30 min 后加入兔抗人Src 單克隆抗體，4 ℃孵育過夜；（4）PBS 洗滌3 次，加入二抗室溫下作用30 min，PBS 洗滌3 次；（5）滴加DAB 顯色液，通過顯微鏡控制反應時間，PBS 終止染色后蘇木素復染，自來水沖洗，PBS 返藍；（6）切片經酒精及二甲苯透明、干燥，中性樹脂封片。

選取高倍鏡視野，參照YOSHIKAWA 法［12］判定結果：（1）兩名病理科專家在不知其臨床病理特征下，顯微鏡下觀察細胞數。（2）將包膜呈黃或棕黃色細胞視為陽性。（3）根據腫瘤細胞染色百分比進行分級：無陽性反應或陽性染色＜5%為（-），≥5%且＜35%為（+），≥35%且＜65%為（++），≥65%為（+++）。

1.3.2 細胞培養TSCC細胞系SCC127用含有10%胎牛血清和100 μg/mL 青霉素的DMEM 培養基培養細胞，培養條件為37 ℃，5%CO2。

1.3.3 細胞轉染取對數期舌鱗癌細胞系SCC127，將細胞接種到6 孔板，待細胞貼壁后更換為不含血清和青霉素的DMEM 培養基，培養6 h 后，將SRC?shRNA 轉染SCC127 細胞系，繼續培養72 h 后，收集細胞用于后續檢驗。

1.3.4 實時熒光定量PCR收集轉染72 h 后的SCC127 細胞，采用TRIzol 試劑提取總RNA。取RNA 使用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，然后將cDNA 作為RT?qPCR 的模板，在反應體系中加入TaqDNA 聚合酶及引物進行分析。SRC 上游引物為5′?CAGTGTCTGACTTCGACAACGC?3′，下游引物為5′?CCATCGGCGTGTTTGGAGTA?3′；GAPDH 上游引物序列為5′?GAAGGTGAAGGTCGGAGTC?3′，下游引物序列為5′?GAAGATGGTGATGGGATTTC?3′；采用2?ΔΔCt法進行量化分析。

1.3.5 蛋白質印跡法分別取已轉染SRC?shRNA和對照NC?shRNA SCC127 細胞，利用RIPA 裂解后，離心提取總蛋白后用BCA法進行蛋白定量。在10%SDS?PAGE 凝膠上分離出30 μg 總蛋白，電泳結束后轉移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入Src 一抗（1∶500 稀釋），4 ℃條件下孵育過夜。第2 天洗膜后，室溫條件下用HRP 標記的山羊抗兔IgG 孵育1 h，PBST 洗膜后加入顯影液曝光顯像。SRC 條帶灰度值反映蛋白的相對表達水平。

1.3.6 細胞增殖實驗利用CCK?8 法評估細胞增殖。取已轉染SRC?shRNA（實驗組）和NC?shRNA（對照組）的SCC127 細胞，以5×103細胞/孔的數量接種到96 孔板中，分別培養24、48 和72 h 后，每孔加入10 μL CCK?8 試劑，37 ℃條件下孵育2.5 h 后，用酶標儀測量在450 nm 波長下的光密度值（OD）。

1.3.7 Transwell 侵襲實驗取已轉染SRC?shRNA（實驗組）和NC?shRNA（對照組）的SCC127 細胞，胰酶消化后離心收集細胞，無血清培養基重懸混勻，調整細胞密度為2.5 × 105個/mL，接種于小室上室，200 μL/孔。待細胞貼壁穩定后，于37 ℃、5%CO2培養箱內培養24 h。輕柔擦棄上室細胞與基質膠，經4%多聚甲醛固定5 min，0.01%結晶紫染色后，雙蒸水漂洗后晾干。隨機選取5 個400 倍視野拍照，計算各組中穿膜細胞數量。

1.3.8 劃痕實驗取已轉染SRC?shRNA（實驗組）和NC?shRNA（對照組）的SCC127 細胞，胰酶消化后計數，將細胞接種于6 孔板（接種數量以次日鋪滿6 孔板一層為宜）。培養24 h 后，在6 孔板中用200 μL 槍頭呈“一”字劃痕，生理鹽水沖洗3 次，更換含血清的DMEM 培養基，劃痕后24 h 觀察細胞的遷移情況并拍照記錄，重復實驗3 次。

1.4 統計學方法用SPSS 25.0 進行統計學分析，采用GraphPad prism 7.0 作圖軟件（Version X，USA）作圖,利用Image J 圖像分析軟件統計Transwell 細胞個數。計量資料用均數±標準差表示，比較方法采用t檢驗，多組比較采用方差分析；計數資料用例（%）表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Src 蛋白在TSCC 組織、癌旁組織的表達Src 蛋白在TSCC 及癌旁組織中均有表達，癌旁組織陽性率為15%（3/20），癌組織陽性率為75%（15/20）。中強陽性率：癌旁組織為0（0/20），癌組織為60%（12/20），差異有統計學意義（P<0.001）。見表1、圖1。

表1 Src 蛋白在舌鱗癌組織及癌旁組織的表達Tab.1 Expression of Src protein in tongue squamous cell carcinoma and paracancerous tissues例

圖1 Src 在TSCC 及癌旁組織的表達Fig.1 Expression of Src protein in tongue squamous cell carcinoma and paracancerous tissues

2.2 TSCC 中Src 蛋白的表達與臨床及病理特征之間的關系不同年齡、性別和腫瘤分化程度患者Src 蛋白表達差異無統計學意義（P> 0.05）。臨床分期Ⅰ、Ⅱ期患者Src 陽性表達率顯著低于Ⅲ和Ⅳ期（P<0.05）；中高分化顯著低于低分化（P<0.05），T1和T2分期顯著低于T3和T4分期（P<0.001）；淋巴轉移者顯著高于無轉移者（P<0.05）。見表2。

表2 TSCC 組織中Src 表達與臨床及病理因素之間的關系Tab.2 Relationship between Src expression and clinical and pathological factors in tongue squamous cell carcinoma

2.3 shRNA 序列對SRC 表達的影響SRC shR?NA?1#和SRC shRNA?2#均可抑制SRC 的表達，且SRC shRNA?2#的效果優于SRC shRNA?1#，見圖2。故本研究主要用SRC shRNA?2#來進行功能研究。

圖2 Western Blot 和定量PCR 檢測SRC?shRNA 對SRC 表達的影響Fig.2 Effect of SRC?shRNA on Expression of SRC by Western Blot and Quantitative PCR

2.4 沉默SRC 抑制舌鱗癌細胞系SCC127 細胞的增殖能力將SRC?shRNA 轉染至舌鱗癌細胞系SCC127 后，利用CCK?8 法檢測沉默SRC 對細胞增殖的影響。結果顯示，沉默SRC 表達可顯著減低SCC127 細胞的增殖，見圖3。

圖3 利用CCK?8 法檢測SRC?shRNA 對SCC127 細胞增殖的影響Fig.3 Effect of SRC?shRNA on proliferation of SCC127 cells by CCK?8 assay

2.5 沉默SRC 抑制TSCC 細胞系SCC127 細胞的侵襲能力Transwell 侵襲實驗結果顯示，與NC?shRNA 組相比，SRC?shRNA 組穿過基底膜的細胞數量明顯減少，差異有統計學意義（P< 0.05），結果表明Src 能夠抑制TSCC SCC127 細胞的侵襲能力。見圖4。

圖4 Transwell 侵襲實驗檢測對照組與實驗組TSCC SSC127 細胞的侵襲能力Fig.4 Transwell invasion assay was used to detect the invasion ability of human tongue carcinoma SSC127 cells in the control and the experimental groups

2.6 沉默SRC抑制TSCC細胞系SCC127細胞的遷移能力劃痕實驗檢測結果顯示，24 h SRC?shRNA組遷移率為（60.93±1.27）%，NC?shRNA組為（77.40± 2.24）%，兩組間差異有統計學意義（P< 0.001），提示沉默SRC 能夠抑制人TSCC 細胞系細胞的遷移能力。見圖5。

圖5 劃痕實驗檢測對照組與實驗組TSCC SSC127 細胞遷移能力Fig.5 Detection of migration ability of human tongue cancer SSC127 cells in control and experimental groups by scratch test

3 討論

TSCC 是口腔頜面部常見的惡性腫瘤,其生物學特征主要表現為局部浸潤生長以及頸部淋巴結轉移。TSCC 的發生發展是一個多因素、多基因參與、多步驟的復雜過程，通過合理檢測腫瘤標志物有助于TSCC 的早期診斷和預后監測，然而單一腫瘤標志物具有局限性，應用多種標志物聯合檢測以增加其敏感性和特異性，對TSCC 患者頸部淋巴結轉移進行監測，具有較高的社會效益［13］。

Src 作為Src 家族蛋白酪氨酸激酶（Src family protein tyrosine kinases，SFKs）的核心成員，在有絲分裂、細胞生長和腫瘤發生等方面發揮了重要作用［14-16］。先前研究表明，Src 在維持細胞侵襲性表型而非細胞周期進程中起作用［17］。在腫瘤細胞的轉移過程中，Src 可以與整合素（Integrin）家族的不同亞型作用，從而影響細胞的運動和轉移［18］。Integrins 為α和β亞單位非共價結合形成的一種跨膜二聚體受體。上調integrin α和β可增加癌細胞的侵襲和轉移［19-20］。Intergrins 介導的細胞黏附作用能夠誘導FAK 產生自磷酸化，從而產生可與Src的SH2 區結合的位點，FAK 與SH2 形成同步化黏著斑FA 連接，這是調節細胞運動的關鍵結構［21］。活化的FAK?Src復合可通過聚集并磷酸化p130CAS蛋白激活Rac1 活性來促進膜突出的形成［22］。此外，Src 的SH3 區還可與intgerin?β3 直接作用，募集并磷酸化Syk，激活Rac1，刺激板狀偽足形成及細胞擴散［23-24］。已有文獻報道多種人腫瘤都有較高水平的Src 蛋白表達，如乳腺癌、結直腸癌和胰腺癌［19，25-26］。HERMIDA?PRADO 等［27］研究發現Src 表達與喉癌疾病進展、淋巴結轉移及腫瘤復發呈正相關，這些都證明了Src 在癌癥發生發展中的作用。已有多種Src 抑制劑被批準應用于治療多種惡性腫瘤，如博舒替尼、達沙替尼、帕納替尼、塞卡替尼等。其中塞卡替尼在復發和轉移頭頸部鱗癌的臨床試驗中無反應［28］，而達沙替尼聯合西妥昔單抗治療有36%轉移性頭頸部鱗癌患者無疾病進展［29］。

本研究結果表明Src 在口腔TSCC 組織中高表達，進一步對患者的臨床病理學特征進行分析后發現，Src 蛋白的表達與患者的年齡、性別無關，但與患者的腫瘤分化程度、臨床分期、T 分期、淋巴結轉移相關，臨床分期越晚、T 分期越晚、淋巴結轉移及分化程度越低者的Src 蛋白表達率越高，提示Src 在TSCC 發展中發揮了重要作用。利用sh?RNA 下調SRC 的表達后，可以抑制TSCC 細胞系SCC127 的增殖，并可以抑制SCC127 的侵襲遷移能力，提示Src 可以促進TSCC 細胞的增殖和侵襲遷移。

綜上所述，Src 蛋白在TSCC 中高表達，且與TSCC 患者預后不良因素相關，下調SRC 可以促進TSCC 細胞系SCC127 的增殖、侵襲和遷移能力，說明Src 蛋白在TSCC 的發展過程中起一定的作用，可為日后TSCC 臨床治療提供新的靶點。