舒芬太尼調控miR-1抑制肝癌細胞MHCC97-H增殖、侵襲和遷移的機制研究

曹峰，劉敏,趙瀟

肝細胞癌是最常見的類型，占肝癌的70%～85%。外科手術仍是肝癌的主要治療措施，早期肝癌病人通過手術治療，如切除部分肝臟或移植，病人5年存活率超過70%。然而，大多數中晚期肝癌病人5年生存率約為15%。近期研究顯示，在圍術期使用的麻醉劑能夠影響病人預后及腫瘤復發。在圍術期有效抑制腫瘤細胞生長和轉移是臨床醫學研究的熱點。

舒芬太尼是臨床上常用的麻醉誘導和輔助麻醉劑，其屬于苯基哌啶類強效阿片類藥物。目前關于舒芬太尼對肝癌細胞侵襲和遷移影響的研究鮮有報道，并且其作用機制尚不明確。多項研究指出微小RNA-1（microRNA-1，miR-1）在人類多種惡性腫瘤，如結直腸癌、前列腺癌和膀胱癌等中表達下調。有關報道顯示，miR-1能夠抑制肝癌細胞增殖、侵襲和遷移，并誘導細胞凋亡。近期有研究顯示，舒芬太尼可通過調控miR-1對大鼠心肌缺血再灌注損傷起保護作用。提示舒芬太尼可能對miR-1的表達具有調控作用。

本研究起止時間為2018年3月至2019年9月，通過觀察舒芬太尼對人肝癌MHCC97-H細胞增殖、侵襲和遷移及miR-1表達的影響，探究舒芬太尼對肝癌細胞影響的機制，以期為舒芬太尼在肝癌治療中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞株MHCC97-H購自中國科學院上海細胞研究所；枸櫞酸舒芬太尼注射液購自宜昌人福藥業有限公司；杜氏改良伊格爾培養基（DMEM）培養基購自美國Hyclon公司；胰蛋白酶和新生小牛血清購自美國Gibco公司；Cell Counting Kit（Cell Counting Kit-8，CCK-8）試劑購自日本同仁研究所；Trizol試劑購自美國Ambion公司；逆轉錄試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-1抑制劑（inhibitor）和陰性對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Corning公司；基質膠（Matrigel）購自美國BD公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、放射免疫沉淀法（RIPA）細胞裂解試劑、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術研究所；鼠抗人基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）單抗及辣根過氧化酶標記山羊抗鼠IgG均購自美國CST公司；實驗所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細胞培養

人肝癌細胞MHCC97-H常規復蘇后培養在含10%滅活小牛血清的DMEM培養基中，加入100 μg/mL青霉素-鏈霉素，放入體積分數為5%二氧化碳、37℃恒溫培養箱中，細胞貼壁生長，每隔2天換液1次，待細胞生長密度達80%以上時，以0.25%胰蛋白酶消化細胞，按照1∶3或1∶4的比例進行傳代培養。

1.3 CCK-8檢測舒芬太尼對MHCC97-H細胞活力的影響

對數期的MHCC97-H細胞以胰酶消化，計數后取100 μL細胞懸液加入到96孔板中，每孔約5×10個細胞，放置在37℃培養箱繼續培養，待細胞貼壁后，棄去就培養液，加入含不同濃度（0、0.01、0.1、1、10、20 μmol/L）舒芬太尼的培養液，分別孵育24、48、72 h，在各個時間點向細胞中加入CCK-8溶液20 μL，繼續孵育4 h，使用酶標儀測定450 nm波長處吸光度值（optical density，OD），分別計算各組MHCC97-H細胞活力，細胞活力（%）=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.4 細胞分組和處理

對數生長期的MHCC97-H細胞接種到6孔板中，接種密度為2×10個/孔，于37℃培養箱繼續培養，將細胞隨機分為4組：對照（Control）組即未做任何處理的MHCC97-H細胞；舒芬太尼（Sufentanil）組即1 μmol/L舒芬太尼干預的MHCC97-H細胞；舒芬太尼和轉染（Sufentanil+miR-1）組即轉染miR-1 inhibitor后施加1 μmol/L舒芬太尼干預的MHCC97-H細胞；舒芬太尼和對照（Sufentanil+NC）組即轉染陰性對照后施加1 μmol/L舒芬太尼干預的MHCC97-H細胞。細胞轉染嚴格參照Lipofectamine 2000轉染試劑使用說明書進行操作，各組MHCC97-H細胞處理48 h后進行相應指標檢測。

1.5 qRT-PCR檢測

各組MHCC97-H細胞處理48 h后，收集細胞，采用Trizol試劑分別提取MHCC97-H細胞中總RNA，使用Nanodrop超微量核酸蛋白檢測儀測定RNA的豐度和純度。選擇合格的RNA進行逆轉錄，按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板，以U6為內參，采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行PCR擴增，反應程序設為：94℃預變性5 min，共1個循環；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40個循環。反應結束后獲取Ct值，并采用相對定量2法分別計算各組MHCC97-H細胞中miR-1相對表達量。所用引物：miR-1 5’-TAGAAGCTTGCCTCTGAGCTGCCTTCTCTA-3’。U6 F-5’-CTTCGGCACGCACATATAC-3’；R-5’-GAACGCTTCACGAATTTGC-3’。

1.6 Western blotting檢測

各組MHCC97-H細胞棄去培養液，用預冷的PBS洗滌細胞3次，用細胞刮刮下細胞，收集細胞，加入配置好的RIPA細胞裂解液，于冰上裂解細胞，離心后收集上清即總蛋白。分別配制12%分離膠和4%濃縮膠，取40 μg蛋白樣品分別加入到每個泳道中，調整電壓行SDS-PAGE電泳。電泳結束后斷開電源，將凝膠上的蛋白采用半干法電轉至PVDF膜上，于5%小牛血清的封閉液中孵育2 h，TBST沖洗膜3次，分別加入1∶500稀釋的一抗，冰上過夜孵育，TBST沖洗膜3次，再加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，TBST沖洗膜3次，化學發光顯影，采用成像系統采集圖像，使用Image J軟件分析圖像中的各條帶灰度值，以β肌動蛋白（β-actin）進行標定，計算各組MGC-803細胞中MMP-2和MMP-9蛋白相對表達水平。

1.7 Transwell實驗

以胰酶消化各組MHCC97-H細胞，離心收集并將細胞密度調整至2×10個/毫升。取200 μL細胞懸液加入到Matrigel基質膠包被的Transwell小室的上室，在下室加入含10%小牛血清的培養液600 μL，放置在37℃培養箱中常規培養48 h。取出小室后棄去培養液，使用棉簽輕輕擦去上室未穿膜的細胞和基質膠，經無水甲醇固定后，漂洗晾干，再使用0.1%結晶紫染色，以PBS洗滌3遍，使用倒置顯微鏡（400倍）觀察，隨機選取5個視野觀察并進行計數穿膜細胞數。

1.8 劃痕實驗

將各處理組MHCC97-H細胞以1×10個/平鋪于6孔板上，在常規培養箱中繼續培養，待細胞呈單層匯合時，用無菌移液槍槍頭垂直劃線，用PBS洗去劃下的細胞，加入不含血清的培養液，在37℃培養箱繼續培養48 h，分別在0和48 h在光鏡下觀察并記錄細胞劃痕距離。分別計算各組MHCC97-H細胞的遷移率，細胞遷移率（%）=（0 h劃痕距離-48 h劃痕距離）×100%。

2 結果

2.1 舒芬太尼對肝癌MHCC97-H細胞活力的影響

CCK-8檢測不同濃度舒芬太尼干預24、48、72 h對肝癌MHCC97-H細胞活力的影響，隨著舒芬太尼濃度的升高MHCC97-H細胞活力隨之下降，在干預24 h時，舒 芬 太 尼 的 濃 度 達 到10 μmol/L時MHCC97-H細胞活力降低（

P

＜0.05），在干預48 h時，舒芬太尼的濃度達到1 μmol/L時細胞活力降低（

P

＜0.05）。基于該實驗篩選出舒芬太尼干預MHCC97-H細胞最適作用濃度為1 μmol/L，最適作用時間為48 h。見表1。

表1 不同濃度的舒芬太尼對肝癌MHCC97-H細胞活力的影響/±s

2.2 各組MHCC97-H細胞miR-1表達比較

在MHCC97-H細胞轉染miR-1 inhibitor后采用1 μmol/L舒芬太尼進行干預，qRT-PCR檢測結果顯示，Sufentanil組MHCC97-H細胞中miR-1的表達水平（2.25±0.24）高 于Control組（1.00±0.09）（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組MHCC97-H細 胞 中miR-1的 表達 水 平（1.42±0.15）低 于Sufentanil+NC組（2.20±0.21）（

P

＜0.05）；而Sufentanil組和Sufentanil+NC組中miR-1的表達水平差異無統計學意義（

P

＞0.05）。

2.3 各組MHCC97-H細胞增殖能力比較

CCK-8實驗結果顯示，Sufentanil組MHCC97-H細胞OD值（0.34±0.03）明 顯 低 于Control組（0.54±0.05）（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組MHCC97-H細 胞OD值（0.46±0.04）明顯高于Sufentanil+NC組（0.32±0.03）（

P

＜0.05）；而Sufentanil組和Sufentanil+NC組細胞OD值差異無統計學意義（

P

＞0.05）。

2.4 各組MHCC97-H細胞侵襲和遷移能力比較

Transwell實驗結果顯示，Sufentanil組侵襲細胞數明顯少于Control組（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組侵襲細胞數明顯多于Sufentanil+NC組（

P

＜0.05）。劃痕實驗結果顯示，Sufentanil組細胞遷移率明顯低于Control組（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組細胞遷移率明顯高于Sufentanil+NC組（

P

＜0.05）。見表2。

表2 各組MHCC97-H細胞侵襲細胞數和細胞遷移率比較/±s

2.5 各 組MHCC97-H細 胞MMP-2和MMP-9蛋白表達水平比較

Western blotting檢測結果顯示，Sufentanil組MHCC97-H細胞 中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平低于Control組（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組MHCC97-H細 胞中MMP-2和MMP-9蛋 白表達水平明顯低于Sufentanil+NC組（

P

＜0.05）；而Sufentanil組 和Sufentanil+NC組 細 胞 中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平差異無統計學意義（

P

＞0.05）。見圖1和表3。

圖1 Western blotting檢測各組MHCC97-H細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

表3 各組MHCC97-H細胞中MMP-2和MMP-9表達水平比較/±s

3 討論

舒芬太尼常做麻醉輔助藥物用于癌癥手術中，近年來，舒芬太尼等阿片類藥物對腫瘤轉移和復發等影響受到國內外研究者的廣泛關注。但關于其對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響亟待研究。因此，本研究采用不同濃度的舒芬太尼干預人肝癌MHCC97-H細胞，CCK-8實驗結果顯示，不同濃度的舒芬太尼對MHCC97-H細胞活力具有不同程度的抑制作用。基于CCK-8實驗結果篩選出最適作用濃度1 μmol/L和最適作用時間48 h，以用于后續實驗加藥標準濃度及處理時間。此外本實驗qRT-PCR檢測結果發現，舒芬太尼處理后MHCC97-H細胞中miR-1的表達水平明顯升高，這與Qiao等人的研究相似，提示舒芬太尼可能調控miR-1的表達。

miR-1能夠參與調控人類多種惡性腫瘤的發生和進展。Xie等報道指出，miR-1在胃癌組織和細胞系中的表達明顯降低，在胃癌細胞中過表達miR-1能夠抑制內皮細胞的增殖、遷移和血管形成，起到腫瘤抑制劑的作用。另一項研究指出，miR-1在卵巢癌組織中表達下調，并且可能通過抑制c-Met表達抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲。在肝癌中，miR-1亦呈低表達，且miR-1可能通過抑制死亡結構域沉默子（BAG4）的表達誘導肝癌Hep3B細胞發生凋亡。為探究舒芬太尼通過調控miR-1的表達影響肝癌MHCC97-H細胞體外增殖、侵襲和遷移能力，本研究通過脂質體轉染技術將miR-1 inhibitor轉染至MHCC97-H細胞下調miR-1的表達。CCK-8、Transwell實驗和劃痕實驗結果發現，舒芬太尼能夠抑制MHCC97-H細胞增殖、侵襲和遷移，而下調miR-1的表達能夠部分逆轉舒芬太尼誘導的細胞增殖、侵襲和遷移抑制作用。本研究表明，舒芬太尼可能通過調控miR-1的表達來影響MHCC97-H細胞增殖、侵襲和遷移。

腫瘤轉移是一個極其復雜的過程，包括腫瘤細胞從原發腫瘤部位脫離，侵犯周圍正常組織，并轉移到遠處部位繼續增殖形成繼發瘤。在該過程中，細胞外基質被降解，血管基底膜被破壞，這些均與基質金屬蛋白酶密切相關。MMP-2和MMP-9均屬于基質金屬蛋白酶家族重要成員，其主要功能是降解細胞外基質蛋白成分。研究顯示，MMP-2和MMP-9表達量與腫瘤細胞侵襲和遷移能力呈正相關。本研究通過Western blotting檢測發現，舒芬太尼干預的MHCC97-H細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達降低，而下調miR-1的表達后MMP-2和MMP-9蛋白表達水平可部分恢復。表明舒芬太尼通過抑制miR-1的表達對MHCC97-H細胞侵襲和遷移能力的抑制作用可能通過下調MMP-2和MMP-9的表達實現的。

綜上，本研究發現舒芬太尼能夠抑制肝癌MHCC97-H細胞增殖、侵襲和遷移，其作用機制可能與抑制MHCC97-H細胞中miR-1的表達有關。