Toll樣受體4與原發性開角型青光眼關系的研究進展

李麗，吳志鴻

原發性開角型青光眼（primary open angle glaucoma，POAG）是青光眼中最常見的類型之一，其病因不明，可能與遺傳有關。眼壓（intraocular pressure，IOP）升高和視神經缺血是POAG的主要危險因素，此外，年齡、種族、糖尿病及高血壓病史等也是導致POAG發病的危險因素。POAG的組織學表現為小梁網膠原纖維和彈性纖維變性，小梁網及schlemm管內壁下細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積等病理改變，這些病理改變引起房水外流受阻，眼壓升高，但不會導致房角關閉，因而稱其為開角型青光眼。POAG發病隱匿，早期僅表現為眼壓不穩定，到晚期才出現視神經損害和視野缺損等視功能嚴重損害，是眼科難治性疾病之一。一些證據表明先天免疫成分參與了原發性開角型青光眼的致病機制，與TLR4激活后刺激機體產生天然免疫反應相關聯，兩者之間關系的研究值得更深入的總結與探討。

1 TLR4的結構和作用

2011年Hoffmann和Beutler發現了天然免疫系統 中 的Toll樣 受 體（Toll like receptors，TLRs）。TLR4來源于TOLL樣受體家族，目前已發現人體內的TLRs有10種，分別是TLR 1～10，它們廣泛表達于中性粒細胞、單核-巨噬細胞等各種免疫細胞及多種內皮和上皮細胞。TOLL樣受體的同源分子都是Ⅰ型跨膜蛋白，可分為胞膜外區，胞漿區和跨膜區三部分，胞膜外區的氮端約有16-28個亮氨酸富集重復序列（leucine-rich repeats，LRRs），主要用來識別病原模式相關分子（pathogen associated molecular patterns，PAMPS）；胞漿區的碳端有TOLL/IL-1受體（Toll/interieukin receptor-1，TIR）結構域，TIR與I型白細胞介素1（interieukin receptor-1，IL-1）受體結構具有同源性，信號轉導途徑也相同，其與IL-1一樣在免疫反應中具有重要作用。TIR不識別分子，但通過TIR-TIR聯合與含TIR的接頭蛋白相互作用來傳遞信號，TIR是Toll樣受體蛋白向下游進行信號轉導的核心元件，所以主要用來激活下游信號通路。TIR有兩個輔助受體，分別是髓系分化抗原（MD2）和LRR結構蛋白（CD14），與TIR共同構成一個三聚體受體。在MD2和CD14的協同作用下，TLR4與配體結合，激活信號傳導通路來發揮相應的細胞效應。

2 TLR4的配體和激活途徑

2.1 TLR4的特異性配體

機體的天然免疫系統依賴于一些模式識別受體（PRRs）來識別配體，損傷相關分子模式（DAMPs）和PAMPs均可識別PRRs。DAMPs是組織或細胞受到損傷和低氧等因素刺激后釋放到細胞間或血液循環中的一類物質，PAMPs則是病毒、真菌、原蟲等病原微生物上的保守結構。TLRs就屬于模式識別受體，對其配體的識別具有特異性，且不同的TLRs識別其對應的配體。

TLRs的配體包括內源性配體和外源性配體，內源性配體是指DAMPs，主要源自細胞外基質的降解成分，如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、纖連蛋白、熱休克蛋白和透明質酸低聚糖等。外源性配體是PAMPs，主要指LPS。LPS是一種由脂質和多糖構成的物質（糖脂質），常來源于革蘭陰性細菌細胞壁外壁，它也是toll樣受體4的主要配體。LPS的生理作用是通過與細胞膜表面的TLR4結合，從而激活信號通路，引起一系列炎性細胞因子和趨化因子釋放，使機體產生免疫應答反應。在血清里，LPS由LPS結合蛋白運送到單核及巨噬細胞細胞膜表面的CD14上，形成一個復合體，再與TLR4/MD2相互作用，激活TLR4下游信號通路。

2.2 TLR4的激活途徑

TLRs的激活途徑根據銜接蛋白不同可分為髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴通路和MyD88非依賴通路。MyD88是Toll樣受體信號通路中的關鍵銜接蛋白分子，由296個氨基酸殘基組成，其羧基末端含有TIR結構域，能與TLR4的TIR結構域結合，并向下傳遞信號，在傳遞上游信號通路和疾病的發展中起著重要作用。MyD88非依賴通路是含有TIR結構域的銜接蛋白誘導干擾素-β［TIR-domaincontaining adapter-inducing interferon（IFN）-β，TRIF］通路，故又稱為TRIF依賴性途徑，兩條通路共同作用促使TLRs被激活，引發機體炎癥反應。在TLRs家族中，TLR3由MyD88非依賴性途徑介導，其他TLRs則由MyD88依賴途徑介導，TLR4也可激活MyD88非依賴性通路產生Ⅰ型干擾素的受體，是唯一一個可由兩條通路介導的toll樣受體。

TLR4/MyD88/NF-κB信號通路：MyD88依賴性途徑中，TLR4與配體結合后形成TLR4/MD-2復合物并二聚化，再與MyD88的TIR結構域結合后激活MyD88，形成有活性的TLR4/MyD88復合物，該復合物可激活細胞內的白細胞介素l受體相關蛋白激酶4（IRAK-4），使白細胞介素l受體相關蛋白激酶-1（IRAK-1）和白細胞介素l受體相關蛋白激酶-2（IRAK-2）兩者磷酸化后形成復合體（IRAKl/2），IRAKl/2與腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）結合，從而激活IκB激酶（IκB kinase，IKK），IKK促使胞質區內的核轉錄因子-κB（NF-κB）活化，最終使NF-κB進入細胞核激活多種炎性基因的轉錄，并進一步翻譯，釋放各種炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β等）和趨 化 因子 等，參 與 免疫 反 應。TLR4/MyD88/NF-κB轉導通路在維持免疫平衡中發揮著重要作用，對移植排斥反應、炎癥性腸病、心肌梗死、心肌炎、缺血再灌注損傷以及腫瘤等多種疾病都起著非常關鍵的作用。

3 TLR4與POAG的關系

3.1 TLR4在青光眼病人視網膜和虹膜組織中表達發生改變

近年來，大量文獻報道青光眼的發病與分子免疫、細胞免疫及自身免疫均有關系，有研究稱自身免疫是POAG發病機制的一個關鍵步驟。POAG使視網膜某些組織成分變化而產生免疫原性，引發自身免疫反應，導致視網膜遭到損害。例如，Boehm等將POAG病人與非青光眼病人（對照組）對比研究，使用抗原微陣列分析兩組受試者房水和血清中的自身抗體反應性，發現與對照組相比，POAG中出現了幾組明顯增加和降低的抗體反應。該研究表明在POAG病人房水和血清中出現的抗體屬于自身免疫抗體，POAG與自身免疫反應相關。

一些證據顯示其在青光眼的視網膜中會發生改變。沙倩建立大鼠慢性高眼壓模型作為實驗組，與空白對照組（正常大鼠）同時行免疫組織化學染色，觀察視網膜上TLR4表達的情況。實驗結果顯示正常大鼠視網膜色素上皮有少量TLR4表達，而高眼壓模型在造模后的1～56 d內TLR4在視網膜上的表達均高于空白對照組，并于第7天達到高峰，然后有所下降，但均高于正常組的表達水平，該研究提示TLR4可能在高眼壓病變中起免疫調節作用。TLR4除了可能在青光眼視網膜中表達上調外，也有證據顯示其可能在虹膜組織中發生表達改變，如王乾、劉新統計了90例急性閉角型青光眼病人，根據視野損傷程度將病人分為輕、中、重三個小組，選取同期入院的32例白內障病人為對照組，并檢測實驗組與對照組病人的虹膜組織中TLR4和MYD88蛋白表達水平。分析結果顯示重度組視神經損傷的TLR4和MYD88的蛋白表達水平明顯高于視神經損傷輕、中組和對照組。TLR4作為一種天然免疫受體，在青光眼病人視網膜和虹膜組織中表達的變化與POAG的相關性，值得更深入一步的研究。

3.2 TLR4基因與POAG的關系

3.2.1 TLR4基因多態性與POAG近幾年來，基因多態性與POAG的關系引起越來越多的人關注，已有證據顯示超過20個候選染色體與POAG相關聯。基因多態性有多種類型，其中最常見的是單核苷酸多態性（single nucleotidepolymorphism，SNP），SNP主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。大量研究發現12個基因（APE1，APOE，CAV1/CAV2，MMP，OPTN，PLXDC2，SLC23A2，TIMP1，TLR4，TMCO1，XRCC1，ZP4）中的20個SNPs可作為POAG的預測風險因子，但未來仍需要更多的證據來驗證。

TLR4基因多態性與POAG關聯的meta分析結果 顯 示，TLR4基 因 中 的rs4986791，rs2149356，rs1927911，rs10759930，rs1927914，rs7037117和rs12377632等多個SNPs與POAG密切相關：TLR4基因多態性可能會增加POAG病人的易感性，在等位基 因 對 比 模 型 中，TLR4 rs1927911，rs2149356，rs4986791，rs7037117和rs10759930增加了POAG的易 感 風 險。對 于 種 族 而 言，rs1927911，rs10759930和rs7037117可能會增加亞洲人的患病風險，而rs12377632和rs2149356可能會增加亞洲人和墨西哥人的患病風險。在日本人群中，rs1927911和rs7037117與POAG和NTG病人有關。在不同的種族和樣本量中TLR4基因多態性對POAG產生的影響有所差異，甚至可能產生完全相反的作用。一項研究表明，TLR4中的rs4986791增加了墨西哥人患POAG的風險，然而另一項對沙特阿拉伯人群的研究卻表明，未檢測到rs4986791與POAG有任何直接關聯。

3.2.2 TLR4基因的上調與POAG TLR4基因的上調與青光眼的神經變性相關，Astafurov等為了弄清楚微生物群引起的慢性亞臨床炎癥是否與中樞神經系統變性有關，先假設慢性亞臨床炎癥（如口腔微生物定植在人類身上引起的炎癥）可能會加劇青光眼的神經退行性變，再通過分析青光眼病人和對照組的人類樣本，最終發現青光眼病人的口腔細菌計數更高。根據觀察結果，為了驗證這一假設，他們在兩種獨立的青光眼動物模型中給予低劑量皮下脂多糖誘發慢性炎癥，兩個月后評估視網膜和視神經中的青光眼神經變性。結果顯示在兩種不同的青光眼動物模型中低劑量LPS給藥均導致了軸突變性和神經元丟失增強，并且觀察到視神經和視網膜中的小膠質細胞活化以及TLR4信號和補體系統的上調；這項研究表明TLR4基因的上調可導致青光眼視神經變性增強。總之，TLR4基因的調節對POAG的發病機制起著非常關鍵的作用。

3.3 TLR4的激活可通過介導TGF-β信號產生作用

轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一種與細胞增殖、凋亡、腫瘤抑制、細胞遷移、細胞生長分化和免疫等相關的多功能細胞因子，屬于TGF-β超家族，廣泛表達于多個組織和器官。在脊柱動物中TGF-β存在5種亞型，其中哺乳動主要有TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3三種亞型，分布于全身，三種亞型功能相似。在這三種同型中，與眼密切相關的是TGF-β2，對TGF-β2-TLR4信號相互作用在青光眼中的作用研究也最為廣泛，也是近年來青光眼病因研究的一個熱點因子。有研究證明，TGF-β2在POAG病人的房水和視神經星形膠質細胞中含量不斷增加，它是導致小梁網和細胞外基質結構變化的關鍵因素。

在某些纖維化疾病，如腎纖維化、肺纖維化及硬皮病等疾病中，TGF-β能使ECM蛋白表達增加，并阻止其降解，促使組織器官纖維化，導致疾病的發生發展。配體激活TLR4能增強成纖維細胞對于TGF-β信號的敏感度，TLR4激活后可通過纖維連接蛋白控制TGF-β信號導致ECM基因的表達，進而引起細胞組織纖維化。

骨形態發生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）和骨形態發生蛋白-4（bonemorphogenetic protein-4，BMP-4）能有效地拮抗TGF-β2誘導的小梁網細胞ECM沉積，而TLR4的激活可抑制骨形態發生蛋白（BMP）假性受體，降低對TGF-β2的拮抗作用，增強TM中ECM的沉積。TLR4也可通過下調活化素膜結合抑制劑（bmp and activin membranebound inhibitor，BAMBI），增 強TGF-β信 號，導 致ECM沉積增加。由此可見，TLR4的激活能夠通過介導TGF-β信號來產生作用。在正常眼的小梁網和視神經乳頭中也存在TGF-β2，但不會產生TM纖維化的作用。有相關證據顯示，TGF-β信號通路激活也能引起視乳頭損傷。

3.4 TLR4的激活導致TM纖維化

TM是小梁細胞粘附于小梁柱上形成的篩網狀結構，房水從小梁網孔引流，引流是否通暢與網孔大小有關。在POAG中，引起IOP升高的主要原因是房水經TM流出受阻，其中的機制包括小梁細胞變性、脫落，TM條索增粗，網眼變窄或閉鎖，引起TM的結構、收縮能力改變和ECM的過度堆積，造成TM纖維化而失去對房水流出的控制，最終導致POAG的發生與發展。ECM是存在于細胞之間的動態網狀結構，研究證明ECM的含量和成分變化會改變TM網孔的大小和流暢程度，進而影響房水外流阻力，引起眼壓的變化。TLR4對TM的影響主要是通過TGF-β來實現的：小梁網ECM增加和TGF-β濃度升高有關，一方面，TGF-β與受體結合能使小梁細胞產生的膠原蛋白、彈性蛋白、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等ECM蛋白增多；另一方面，在正常生理情況下，基質金屬蛋白酶類（matrix metalloproteinase，MMPs）及基質金屬蛋白酶類組織抑制因子（TIMPs）相互作用，使ECM的合成與降解處于一種平衡狀態，當這種平衡被打破，會導致ECM的沉積及其結構成分改變。MMPs是一組金屬離子依賴的蛋白酶，能降解ECM；TIMPs是MMPs的天然拮抗因子，能阻止MMPs吸收金屬離子，抑制其活性。TGF-β可促進小梁細胞合成基質金屬蛋白酶類抑制因子和組織纖維蛋白溶酶原激活因子等物質，可抑制MMPs的活性，間接阻止ECM降解；也有報道證實TGF-β能夠促進人小梁細胞合成轉谷氨酰胺酶，該酶能改變ECM結構，使其穩定性加強，對化學、機械和酶的抵抗力增強，最終導致ECM降解減少。以上幾種方式均會導致ECM堆積，房水流出受阻，引起POAG發病。總之，TLR4激活后與TGF-β相互作用可導致TM纖維化。

3.5 TLR4的 激 活 在POAG中 對RGC的 影 響

POAG的特征性改變是視網膜大量RGC凋亡、損傷及其突觸的變性，引起視神經進行性損傷，最終導致病人視野缺損，視力喪失。RGC的凋亡可能由青光眼病人眼壓升高引起視網膜缺血-再灌注損傷誘導發生。一方面，視網膜缺血-再灌注損傷會導致組織細胞產生一系列炎性因子，如高遷移率族蛋白B1、熱休克蛋白-72等TLR4內源性配體，這些內源性配體能被TLR4識別并觸發信號傳導，引起組織損傷，給予TLR4阻斷劑后可降低損傷。內源性配體激活TLR4可能是缺血-再灌注損傷引起RGC凋亡的主要免疫應答方式。另一方面，小膠質細胞是腦內重要的神經細胞，分布于整個中樞神經系統，具有抗原呈遞的作用，同時也能分泌細胞炎性因子，參與機體免疫反應。視神經屬于中樞神經系統的一部分，其中神經膠質細胞占90%以上，這些神經膠質細胞在青光眼發病中起著重要的調節作用。小膠質細胞對神經炎癥反應靈敏，能迅速被激活，激活的小膠質細胞形態功能發生變化，活化后細胞體積增大，形態各異，功能上出現增殖、遷移、吞噬等改變，同時分泌細胞因子和細胞毒性物質，參與損傷所致炎癥，在炎癥后期，則分泌神經營養因子，有利于神經元的營養與修復。小膠質細胞在正常眼中維持其正常功能，參與炎癥反應，防止視神經出現不可逆損傷，其介導的神經炎癥在疾病的轉歸過程中也有非常重要的作用，但是小膠質細胞過多激活或失控會分泌大量的炎癥介質，引起神經毒性，因此小膠質細胞既能保護神經，也能損傷神經。在POAG中，TLR4與小膠質細胞大量結合，使其過度活化后，對視神經元產生細胞毒性效應，從而導致RGC大量死亡，視神經進行性損害。所以，激活后的TLR4信號通路既發揮本身固有的作用，又通過小膠質細胞損傷RGC。

4 TLR4與POAG的治療與展望

TLR4引起炎癥反應的整個過程中，需要多個因子及細胞的參與，抑制每個環節都可能影響疾病的進展。以TLR4作為靶位，抑制TLR4表達或阻斷TLR4信號通路可能為臨床預防和治療POAG提供新的策略。目前，正在研究且已有應用于臨床治療的有TLR4抑制劑和基因敲除，可治療動脈粥樣硬化血管疾病和系統性紅斑狼瘡等疾病；在POAG中，TLR4抑制劑和基因敲除通過阻斷TLR4信號通路的方式來抑制TM纖維化和視神經損傷，例如有一種小分子環己烯衍生物TAK-242即乙基（6R）-6-［N-（2-氯-4-氟苯基）氨磺酰基］環己-1-烯-1-羧酸酯，它通過結合TLR4細胞內結構域的元件來阻礙TLR4與銜接蛋白的相互作用，抑制TLR4的信號傳導，達到治療POAG的目的。另外，也能以TGF-β作為靶位，通過抑制TGF-β信號通路來抑制TM纖維化，即靶向TGF-β治療POAG。目前一種靶向調節TGF-β2信號通路的反義寡核苷酸正在用于臨床試驗，該反義寡核苷酸可降低TGF-β2的產生，此實驗目的是評估其對改善接受小梁切除術的POAG病人的手術效果。但有關這方面的研究目前尚不完善，仍需進一步的實踐與應用。

除了以TLR4和TGF-β2作為靶點來治療POAG的方式外，還需更深層次地挖掘TLR4信號通路的各個分子及其作用，為POAG的治療尋找新途徑。