促紅細胞生成素對低出生體質量新生大鼠缺氧缺血后腦神經細胞凋亡的影響

王超，姜紅春，劉丹

在兒童早期防治成人期疾病已經成為世界范圍的熱點和趨勢，新生兒體質量過低可能會導致缺氧缺血性腦病（HIE）。HIE是在圍生期窒息引起的腦血流減少導致的腦損傷。目前我國新生兒HIE發病率高達3%～10%，雖然因地區不同而不同，但由此引起的行為障礙嚴重影響我國人口素質的提高。促紅細胞生成素（EPO）作為一種能夠調節血細胞生成的細胞因子，目前可以由人工合成與天然相同氨基酸序列的糖蛋白，其能緩解腦部損傷，降低相關凋亡蛋白的合成保護HIE病人的腦神經細胞。但目前關于EPO對缺氧缺血后腦神經細胞凋亡的影響機制尚不能完全統一。2019年1—8月進行本研究，旨在觀察EPO對低出生體質量新生大鼠缺氧缺血后腦神經細胞凋亡的影響，以期了解為臨床研發HIE新藥提供數據資料。

1 材料與方法

1.1 材料

低出生體質量（LBW）新生SD大鼠80只，SPF級，體質量（4.0±0.2）g，購自廣東省醫學實驗動物中心［SCXK（粵）2018-0002］。飼養溫度20～25℃，相對濕度50%～65%，本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 藥物與試劑

EPO（純度＞99.9%）購自上海凱茂生物醫藥有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche公司；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司；B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）抗體（貨號sc-7382，批號20190201）、Bcl-2相關X（Bax）抗體（貨號sc-7480，批號20190301）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）（1∶500，貨號201872169）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）（貨號2018630258）購自武漢華聯科有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、HRP羊抗鼠IgG等二抗購自美國Thermo公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購于杭州四季青生物工程材料有限公司；PVDF膜、ECL發光液購自美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 分組及模型建立將80只大鼠適應性喂養1周后，以隨機數字表法選20只為空白對照組，將余下大鼠采用結扎左側頸總動脈并吸入80 mL/L氧氣2 h制作新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）動物模型。具體操作如下：讓大鼠吸入乙醚，消毒后從頸左側切口，分離左側頸總動脈結扎左側頸總動脈，縫合皮膚。2 h后放置于缺氧艙內，通入氧體積分數為80 mL/L持續2 h，待大鼠蘇醒后返回母鼠身旁哺乳喂養。

1.3.2 藥物干預完成大鼠模型建立后，低劑量EPO組和高劑量EPO組大鼠分別腹腔注射EPO，注射劑量分別為2 500 IU/kg和5 000 IU/kg，每日一次，連續注射7 d，模型組和空白對照組分別同時間注射等量生理鹽水。藥物使用劑量參考梁增紅研究。

1.3.3 檢測項目HE染色：將實驗大鼠的腦組織經甲醛固定，乙醛脫水處理制備石蠟標本，采用LD-66實驗室切片機（長沙益廣制藥機械公司）進行4 μm厚切片，HE染色后采用SG-51型正置型金相顯微鏡（上海光學儀器廠）在400倍光鏡觀察腎小球結構。

TUNEL法檢測大鼠神經細胞凋亡：取各組大鼠腦組織切片，按照TUNEL試劑盒說明要求書操作，DAB顯色后二甲苯固定，晾干，熒光封片試劑封片。熒光顯微鏡下觀察結果：凋亡指數（%）=陽性細胞/總細胞×100%。

Western blotting檢測蛋白表達水平：取大鼠腦組織，消化后、提取總蛋白，轉移至PVDF膜，經脫脂奶粉封閉，加入Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2等一抗孵育過夜，加入HRP標記二抗，孵育2 h，將βactin作為內參蛋白，ECL化學發光試劑顯色，在凝膠成像系統（色列DNR公司）檢測分析蛋白條帶。

流式細胞儀檢測大鼠后腦神經細胞凋亡：取大鼠腦組織，剪刀剪碎后制成細胞懸液，4℃離心5 min收集細胞；加入100 μL Binding Buffer重懸，加入5 μL Annexin V-FITC/PI工作液混勻；室溫避光孵育15 min，采用MoFlo XDP型流式細胞儀（賽默飛世爾科技有限公司）檢測大鼠后腦組織細胞凋亡情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0分析數據，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-

t

檢驗；

P

＜0.05表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色觀察神經細胞凋亡

空白對照組中，神經細胞密集、排列有序，層次清晰、分明；模型組中，神經細胞細明顯腫脹壞死、空化、間隙增寬、大量細胞丟失且排列稀疏；低劑量EPO組中，部分細胞輕度水腫、空化、排列稀疏；高劑量EPO組中，少量細胞出現水腫、間隙增寬不明顯、細胞層次較為分明，排列有序。見圖1A。

圖1 大鼠神經細胞凋亡：A為HE染色圖（HE×400）；B為TUNEL法檢測（TUNEL×400）

2.2 TUNEL法檢測大鼠神經細胞凋亡

空白對照組中，神經細胞無凋亡；模型組中，神經細胞大部分出現凋亡；低劑量EPO組中，部分神經細胞出現凋亡，高劑量EPO組中，少量神經細胞出現凋亡，見圖1B。空白對照組、模型組、低劑量EPO組、高劑量EPO組大鼠神經細胞凋亡率分別為（10.21±2.00）%、（65.85±10.48）%、（40.32±5.22）%、（20.79±2.33）%，相比空白對照組，模型組大鼠神經細胞凋亡率顯著升高（

P

＜0.05）；相比模型組，低劑量EPO組大鼠神經細胞凋亡率顯著降低（

P

＜0.05）；相比低劑量EPO組，高劑量EPO組大鼠神經細胞凋亡率顯著降低（

P

＜0.05）。

2.3 凋亡相關蛋白表達

相比空白對照組，模型組大鼠腦組織Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量顯著升高（

P

＜0.05）；相比模型組，低劑量EPO組大鼠腦組織Bcl-2蛋白相對表達量顯著升高，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量顯著降低（

P

＜0.05）；相比低劑量EPO組，高劑量EPO組大鼠腦組織Bcl-2蛋白相對表達量顯著升高，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量顯著降低（

P

＜0.05）。見圖2、表1。

表1 各組小鼠凋亡相關蛋白表達/±s

圖2 各組小鼠凋亡相關蛋白表達（Western blotting檢測）

2.4 流式細胞儀檢測大鼠后腦神經細胞凋亡

空白對照組、模型組、低劑量EPO組、高劑量EPO組大鼠后腦神經細胞凋亡率分別為（5.32±0.87）%、（22.36±4.52）%、（15.23±2.12）%、（10.36±1.98）%，相比空白對照組，模型組大鼠腦組織神經細胞凋亡比例與正在凋亡的腦組織神經細胞顯著升高（

P

＜0.05）；相比模型組，低劑量EPO組大鼠腦組織神經細胞凋亡比例與正在凋亡的腦組織神經細胞顯著降低（

P

＜0.05）；相比低劑量EPO組，高劑量EPO組大鼠腦組織神經細胞凋亡比例與正在凋亡的腦組織神經細胞顯著降低（

P

＜0.05）。見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測大鼠后腦神經細胞凋亡

3 討論

EPO是一種調節血細胞生成的細胞因子，具有促進紅系祖細胞分為紅細胞使得紅細胞數量增加，加強機體對養分的利用，同時EPO還具有非造血功能，是一種具有抗凋亡活性的細胞因子。可有效緩解缺血缺氧導致的腦損傷。李晶晶等研究表明EPO可以與EPOR的同源二聚體結合調節造血反應，對缺血后的腦組織有一定的保護效果。目前臨床上將EPO作為腎性貧血的常規用藥，同時目前已有較多的研究證實EPO具有神經保護作用。

本研究通過HE染色觀察腦組織神經細胞發現，模型組大鼠神經細胞細明顯腫脹壞死、空化、間隙增寬、大量細胞丟失且排列稀疏；使用EPO處理后的各組大鼠部分細胞輕度水腫、間隙增寬不明顯、細胞層次較為分明，排列有序，提示EPO對于改善大鼠腦神經細胞水腫現象具有十分積極的作用。同時本研究檢測了大鼠神經細胞凋亡情況發現，相比模型組，使用EPO處理后的各組大鼠腦神經細胞的凋亡率顯著下降，說明EPO對于抑制腦神經細胞的凋亡也具有十分積極的作用。鞠飛等研究報道，EPO對于缺血血壓后神經損傷具有一定程度的抑制作用，與本研究結論類似。一方面，EPO可以有效激活細胞內的鈣離子通道，減輕谷氨酸毒性，促進血管生成，從而增加大鼠腦內缺血區的血流量及氧合作用；另一方面，EPO可阻止自由基釋放，影響神經遞質的釋放和抗炎作用，從而對中樞和外周神經系統起到神經保護作用。

研究顯示，細胞凋亡過程可受到多種基因的調控，而Caspase家族基因，如Caspase-3、Caspase-9是常見的細胞凋亡調控基因之一。Caspase-9是線粒體凋亡途徑的關鍵蛋白酶，其作為啟動子，處于激活的頂端，可參與啟動細胞程序性死亡，Caspase-3則是凋亡的主要執行者。Bcl-2家族基因也可以調控細胞的凋亡，其中最常見的包括Bcl-2和Bax。Bax是凋亡基因，可以促進細胞凋亡；Bcl-2則是抑凋亡基因，能夠抑制多種細胞毒因素所引發的細胞死亡，表現出抑制細胞凋亡的作用。張晶等指出，EPO可以通過抑制腦神經細胞的凋亡來發揮神經保護作用，抑制新生大鼠腦組織中凋亡相關因子的表達。本研究在LBW新生HIBD大鼠中發現了類似的結論，結果顯示，相比模型組，流式細胞儀檢測EPO處理后組大鼠腦組織神經細胞凋亡比例與正在凋亡的腦組織神經細胞顯著降低。同時流式細胞儀檢測結果顯示，使用EPO處理后組大鼠腦組織神經細胞凋亡細胞顯著減少，同時正在凋亡與即將凋亡的細胞百分比也顯著減少。這可能是因為，EPO能夠作用于凋亡相關基因，從而實現對細胞凋亡相關蛋白表達的調節，最終達到抑制腦神經細胞凋亡的目的。

綜上所述，EPO對于LBW新生大鼠缺氧缺血后腦神經細胞具有一定的保護作用，其機制可能與抑制凋亡蛋白的表達并促進抑凋亡蛋白的表達有關。但因EPO抑制新生大鼠缺氧后神經細胞的凋亡涉及的信號通路較多，在后續的實驗中將進一步探討信號通路在保護新生大鼠缺氧后神經細胞的凋亡的作用機制。