無患子皂苷的提取及抑菌性研究

邵玲莉，錢思，施曉秦，嚴蘭琴

無患子（Sapindus mukorossi），又名木患子、肥皂樹，是南方常見的行道樹和庭院樹。據《本草綱目》記載，無患子果皮具有清熱祛痰，消積殺蟲、洗面祛斑等作用，中醫上可用于咳喘、食滯、白帶、疳積、瘡癬、腫毒等的治療。現代研究表明，無患子果皮中主要的活性成分為無患子皂苷，它是一種天然的表面活性劑，具有良好的去污性、起泡性和殺菌抑菌、去屑止癢、抗炎、抗病毒、抗氧化以及對污染土壤的修復性等特殊的生物活性，因此在醫藥、日化以及環境領域的價值倍受重視，具有很大的開發潛力和廣闊的市場前景。

無患子皂苷的提取研究較多，傳統方法主要包括水提法和有機溶劑提取法。張永忠等對無患子總皂苷進行超聲提取工藝條件優化，其提取率為3.14%，馬麗珍采用水提醇沉法研究了無患子皂苷的提取工藝，無患子皂苷提取率為3.65%，黃素梅等優化后的無患子皂苷的提取條件是樣品與乙醇比例為1∶9（質量體積比）時，在60℃下提取3次，每次3 h，所得皂苷產率為9.32%，鄭林祿等采用復合酶法探究了無患子皂苷的最佳工藝條件，歐霖拱利用大孔樹脂吸附法對無患子皂苷進行了分離純化，無患子皂苷純度達到90.27%。以上研究取得了一定的效果，但是也存在提取率低、溶劑損失大、或者成本高等局限性。相比傳統的提取方法，超聲波提取法因操作簡單、提取速度快、提取得率高等特點，在天然植物有效成分的提取方面表現出很大的應用潛力及良好的發展前景。本研究以乙醇為溶劑，采用超聲波輔助法提取無患子果皮中的總皂苷。在前期單因素試驗基礎上選取料液比、乙醇體積分數、超聲時間和提取次數四個主要影響因素，通過正交試驗優化無患子皂苷的提取條件，并對提取液進行抑菌試驗研究，以期為無患子皂苷的進一步開發利用提供借鑒和參考。本研究起止時間為2018年3月至2019年3月，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：無患子果皮，購自金華九德堂大藥房。供試菌種：大腸桿菌（

Escherichia coli

）、枯草芽孢桿菌（

Bacillus subtilis

）、金黃色葡萄球菌（

Staphylococcus aureus.

）、青霉菌（

Penicillium glaucum.

）、黑曲霉（

Aspergillus.niger

）、白色念珠菌（

Candida tropicalis

），均由金華職業技術學院醫學院提供。

試劑：齊墩果酸標準品（上海一基實業有限公司，批號20180505）；無水乙醇，甲醇，香草醛，冰醋酸，濃硫酸。牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖等試劑均購自金華東南化工儀器有限公司，土豆購自金華農貿市場。

儀器：JY99-Ⅱ型超聲提取裝置（寧波新芝生物科技股份有限公司）；電子精密天平（寧波海曙天宏稱重設備有限公司）、752紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）、旋轉蒸發器RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）、J02005型手搖木塞打孔機（浙江上虞醫療器械廠）、HH-6型數顯恒溫水浴（常州天瑞儀器有限公司）；SW-CJ-IF超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；SHP-150生化培養箱（上海森信實驗儀器有限公司）；震蕩培養箱（常州國華電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 無患子總皂苷的提取方法準確稱取10.00 g無患子果皮碎末，置錐形瓶中，加入一定量的提取溶劑，搖勻，采用L9（3）正交試驗，利用超聲波輔助法進行提取優化。

1.2.2 總皂苷含量測定方法采用比色法標準曲線的制備：精密稱取齊墩果酸標準品10.00 mg，置于燒杯中，用甲醇溶解并定容至10 mL的容量瓶中，搖勻，得1 mg/mL的標準品溶液。分別取0、50、100、150、200、250 μL標準溶液于六支比色管中，揮干溶劑后加入5%香草醛冰醋酸溶液0.3 mL（現配現用）、70%硫酸溶液4.5 mL，混勻，60℃下放置20 min顯色，之后立即用流水冷卻，加2 mL冰醋酸稀釋混勻，以空白溶液作為對照，測553 nm處的吸光度，重復3次。計算回歸方程為y=555.23x-79.201（

R

=0.999 4），線性范圍50～250 μg/mL，線性關系良好。

樣品總皂苷的含量測定及提取得率計算：將1.2.1項下所得提取液適當稀釋，取0.5 mL溶液于試管中揮干試劑后按上述標準曲線所示方法進行操作，所得吸光度值代入上述回歸方程，按下式計算樣品在不同提取條件下的皂苷提取率。皂苷提取得率（%）=［皂苷質量（g）/無患子果皮質量（g）］×100%。

1.2.3 抑菌活性測定方法采用濾紙片擴散法，所用濾紙片直徑為6 mm。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂15～20 g、加水至1 000 mL。

土豆培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、加水至1 000 mL。

供試菌種菌懸液的制備：（1）金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌菌懸液的配制。從4℃的冰箱中取出供試菌種，接種于新鮮液體培養基，在37℃下恒溫培養24 h活化（白色念珠菌在28℃下恒溫培養48 h活化），用移液槍吸取1.0 mL菌原液于9.0 mL無菌水中，得到稀釋10倍的菌懸液，依次操作，直至稀釋度為10，備用。（2）青霉菌、黑曲霉菌懸液的配制。取活化好的黑曲霉菌和青霉菌，用一定量無菌水沖洗孢子，利用比濁法制成110 cfu/mL菌懸液，4℃備用。

2 結果與分析

2.1 無患子總皂苷提取正交試驗

按下表的因素與水平，對無患子皂苷進行提取優化。所得提取液過濾后適當稀釋，測吸光度，計算皂苷提取量。見表1。

表1 正交試驗因素、水平及結果

極差分析表明，各因素的影響主次順序為D＞B＞A＞C，根據K值的大小可知，因素的最佳水平為ABCD，由于因素A的影響不太顯著，且A與A相比差別不大，因此從節約溶劑的角度考慮，最終確定的最佳提取工藝為ABCD，即A（固液比）、B（乙醇濃度）、C（超聲時間）、D（提取次數）分別為1∶5、70%、60 min、3次。在此條件下，無患子總皂苷提取得率為25.33%。

2.2 無患子皂苷抑菌活性試驗

上述優化試驗所得提取液利用旋轉蒸發濃縮，得到濃度約為1.77 g生藥材/毫升的濃縮液，將已滅菌濾紙片在提取濃縮液中浸泡0.5 h后取出，逐個貼于涂布有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌、青霉菌菌懸液的培養基表面。每個菌種設3個平行，并以無菌水做對照。細菌于37℃下培養24 h，白色念珠菌于28℃的培養箱中培養48 h，青霉菌和黑曲霉于28℃下培養72 h后觀察。

通過抑菌試驗發現，無患子提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌基本無抑菌效果，對白色念珠菌、黑曲霉及青霉菌抑菌效果明顯。

2.3 最低抑菌濃度的測定

在無患子皂苷抑菌譜研究的基礎上，對濃縮液進行一系列稀釋，測定其最低抑菌濃度。試驗結果見表2。

表2 抑菌圈長徑/mm

從表2可以看出，無患子提取液濃度不同，其對真菌的抑菌效果也不同，濃度越高，抑菌圈長徑越大，抑菌效果越好。并且，對不同的真菌，抑菌效果不同，對青霉菌的抑菌效果最好，濃縮液稀釋32倍時仍有抑菌效果，即最小抑菌濃度為0.05 g生藥材/毫升提取液。對黑曲霉和白色念珠菌的最小抑菌濃度分別是稀釋度為4倍和16倍。

3 討論

無患子總皂苷的超聲輔助提取中，影響因素較多，除了提取次數、時間、料液比、乙醇濃度之外，還有超聲波功率、溫度、溶劑等，根據資料查閱和前期的提取試驗結果，本研究超聲功率采用200 W，溫度60℃，皂苷提取也可以用水提法，考慮到水提過程中往往會將一些單糖、寡糖、氨基酸、蛋白質、黏液質等提取出來，雜質較多，且苷類物質與水接觸時間過長易水解而失去生物活性，因此選用乙醇為提取溶劑。

提取物的抑菌試驗發現，無患子總皂苷對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌等細菌有短時效的抑菌效果，培養20 h時有明顯的抑菌圈出現，但當培養時間延長至30 h后，抑菌圈里會逐漸長出小菌落，所以，總的來說，對上述細菌抑菌效果不明顯。對真菌的抑菌效果顯著，特別是對青霉菌和白色念珠菌，這為進一步開發利用無患子的藥用價值提供了科學依據和參考。