RAC1對惡性腫瘤的調控作用及其分子機制研究進展

王琛瑤，梁百慧，吳錦源，唐梓涵，許小文，尹梓健，丁雅瓊，方雄釗，李栢芝，文姝佚，程轉，詹涵，張粵烽，王泫哲，何仕龍，張可洵，劉雅騏，周飛，熊興東，白春英，許麗艷，李恩民，

(1.汕頭大學醫學院生物化學與分子生物學教研室，廣東汕頭515041；2.汕頭大學醫學院基礎醫學研究所，廣東汕頭515041；3.赤峰學院基礎醫學院，內蒙古赤峰024076；4.廣東醫科大學基礎醫學院，廣東東莞523808；5.韓山師范學院生命科學與食品工程學院，廣東潮州521041)

RAS相關C3肉毒桿菌毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1)是Ras超家族中Rho亞家族的核心成員。人類的RAC1基因位于7號染色體短臂2區2帶1亞帶，含有兩個轉錄本。編碼RAC1蛋白的轉錄本長度為2 309 nt(NM_006908.5)，編碼192個氨基酸；編碼RAC1b蛋白的轉錄本長度為2 366 nt(NM_018890.4)，編碼211個氨基酸。RAC1和RAC1b是高度同源的剪接變體，剪接亞型RAC1b在1999年首次被描述，包括了1個額外的外顯子3b緊接在開關II區域后面，該外顯子中插入了19個氨基酸，這種插入導致其核苷酸交換率增強并且延遲GTP水解，因此，在大多數細胞中，RAC1b處于GTP結合的活性狀態，該剪切亞型可能不是肌動蛋白細胞骨架的直接調節因子，因此本文不予詳述。RAC1主要存在于細胞質與細胞偽足處，這是RAC1蛋白參與細胞運動調控的形態學證據。RAC1是一種結構簡單的GTP酶蛋白，其折疊方式由中心區域的β片層和周圍是α螺旋組成，RAC1含有1個核心的結構域，即G結構域，該結構域含有5個一致性元件，主要位于其β片層的C端以及α螺旋的連接處，該位置組成了核苷酸的結合位點，其前3個一致性元件(P-loop、開關Ⅰ、開關Ⅱ)與GTP和GDP的結合有關。RAC1的功能高度依賴于其GTP結合態和GDP結合態之間的轉換。前者是活性態，相當于開關的開啟狀態，介導相關細胞信號傳導；后者是失活態，相當于開關的關閉狀態，阻斷相關細胞信號轉導。RAC1蛋白的GTP結合態/活性態和GDP結合態/失活態之間的循環切換，受鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)、GTPase激活蛋白(GTPase-activating proteins，GAPs)和GDP解離抑制因子(GDP dissociation inhibitors，GDIs)三者的協同調控。通常情況下，RAC1主要處于與GDP結合的失活態，而鎖定這種狀態主要依靠GDIs。當接收到激活信號時，非蛋白酪氨酸激酶SRC受體(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC)催化GDIs與RAC1-GDP之間的解離；而失活態RAC1-GDP在GEFs的作用下會生成激活態RAC1-GTP；激活態RAC1-GTP在GAPs作用下水解，生成失活態RAC1-GDP。以上被稱為RAC1/GTPase循環，詳見圖1。

圖1 RAC1/GTPase循環

1 RAC1對惡性腫瘤細胞增殖的調控及其分子機制

細胞增殖是生命活動的基本特征。正常細胞的周期分為4期，G1期為DNA復制做準備，S期進行DNA復制，G2期為有絲分裂做準備，M期為有絲分裂期。在細胞周期中，G1期的啟動是關鍵。G1晚期有決定細胞周期的限制點，細胞需要接受生長因子的持續刺激，才能通過該限制點進入S期，否則進入相對靜止的G0期。這些生長因子的刺激信號會通過活化細胞膜酪氨酸激酶受體(receptor protein tyrosine kinase，RTKs)、RAC1/PI3K/AKT、RAC1-PAKs以及RAC1/JNK/c-Jun等信號通路將細胞增殖信號傳至細胞內部。而腫瘤惡性增殖的核心事件是正常的細胞周期進程被破壞，上述相關調控蛋白和信號轉導通路發生改變，使腫瘤細胞接收一系列異常信號，順利通過細胞周期限制點，進入細胞周期進程，失去分化能力，發生惡性增殖。因此，長期以來有關細胞周期信號通路的研究，一直是腫瘤學研究領域的熱點。2018年發表的一項研究表明，激活胃癌細胞中的RAC1/PI3K/AKT通路可以通過影響細胞周期促進細胞增殖活力。2020年發表的研究表明，RAC1可以促進食管癌細胞的生存能力，在食管癌細胞中下調RAC1可以通過阻斷phosphoinositide 3-kinase/AKT/mTOR通路來抑制食管癌細胞的增殖、侵襲和遷移。最新研究報道，轉移性前列腺癌相關基因編碼蛋白DEPDC1B能通過與RAC1結合，激活PAK1通路，誘導上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和促進細胞增殖，這種DEPDC1B介導的致癌作用可被RAC1-GTP抑制劑或

RAC1

基因沉默所逆轉，該研究提示RAC1可能作為臨床干預轉移性前列腺癌的重要靶點。另有研究發現，c-Jun能對組織發育和疾病的不同信號進行串擾、放大和整合。在細胞內，c-Jun的轉錄活性調控可通過RAC1/SAPK/JNK對c-Jun的Ser63/Ser73磷酸化實現，RAC1會通過干擾RAC1/SAPK/JNK/c-Jun信號的傳遞，阻斷正常細胞周期的進行，影響細胞的增殖。上述研究表明，抑制RAC1在腫瘤細胞中的異常過表達，能夠阻斷腫瘤細胞的惡性增殖。

2 RAC1對惡性腫瘤細胞遷移的調控及其分子機制

腫瘤細胞的遷移由4個步驟組成：頭部細胞絲狀偽足的形成和延伸以探測細胞運動的方向，緊接著細胞形成片狀偽足并建立新黏附位點提供細胞向前運動所需的黏附力，最后胞體的收縮，以及細胞尾部的退縮完成一個細胞的運動周期。腫瘤細胞通過重復此4個過程不斷向前遷移。在多條信號通路中，RAC1是關鍵的調控因子，處于中樞位置，主要參與對細胞骨架重組和細胞黏附基質的調控，進而控制細胞的遷移過程。細胞形態改變和細胞偽足的形成是細胞侵襲遷移的起始步驟，RAC1可通過調控其下游效應因子WASP(wiskott-aldrich syndrome protein，WASP)蛋白家族，誘發膜皺褶，促進片狀偽足形成。新形成的片狀偽足能與周圍基質形成黏附連接，產生細胞向前運動的錨著位點。細胞遷移頭部高度動態性偽足結構的形成依賴肌動蛋白單體聚合和肌動蛋白纖維的延長，WASP家族不同成員通過不同的結構域與RAC1結合而被活化。細胞偽足的形成還依賴另一種關鍵調節因子Cofilin，Cofilin可使肌動蛋白絲被切割，產生新的肌動蛋白絲末端。RAC1通過與二聚化的PAKs(p21 activated kinases)分子的結合域PBD結合，恢復PAKs活性。見圖2，激活下游的效應分子LIMK1/2(LIM domain kinase 1/2)，進一步磷酸化Cofilin，使Cofilin失活，抑制肌動蛋白絲被切割，穩定肌動蛋白絲細胞骨架。新黏附位點的建立是細胞遷移的第2個步驟，細胞持續的遷移需依賴細胞偽足與細胞外基質(extracellular metrax，ECM)的穩定黏附，提供細胞向前遷移的牽引支點。遷移的細胞頭部與ECM的黏附，以及尾部與ECM的去黏附不斷交替使得細胞向前遷移，RAC1對這一過程發揮精確的調節作用。細胞表面的整合素受體與ECM中特異的配體結合，通過整合素聚集成簇而形成黏著斑復合物(focal adhesion complex，FAC)，并與細胞骨架相連，提供細胞遷移的錨著位點。活化的RAC1能激活PAK1，而PAK1能進一步磷酸化下游的黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)，促進新的FAC的形成。細胞胞體的收縮和細胞尾部的退縮是遷移最后的兩個環節，這兩個環節需要依靠張力纖維收縮和肌動蛋白絲的延長提供動力，RAC1可通過調節細胞骨架的重組，為細胞遷移提供動力。文獻報道，抑制RAC1/PAK1/LIMK1通路的激活可衰減EMT，從而抑制胃癌細胞遷移和侵襲。一項2018年發表的研究表明，細胞內成熟的抗炎因子IL-37直接與RAC1的C端高變區CAAX基序結合，進而抑制RAC1膜易位及隨后的下游信號傳導，進一步抑制細胞的遷移。目前，已經明確RAC1在腫瘤的侵襲遷移中發揮非常關鍵的作用，RAC1可能作為評價腫瘤惡性程度與預測腫瘤侵襲遷移的新型標志物。有理由相信，隨著相關研究的不斷深入，RAC1在腫瘤侵襲遷移中的作用機制會愈加明確。

圖2 RAC1-GTP激活下游效應蛋白PAKs機制示意圖

3 RAC1對惡性腫瘤細胞代謝的調控及其分子機制

糖酵解信號通路由調控糖酵解代謝的關鍵酶組成，主要包括己糖激酶(hexokinase，HK)、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PKM1/2)、丙酮酸脫氫酶和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)等。有氧情況下，丙酮酸脫氫酶復合體在NAD存在下催化丙酮酸和CoA轉化成乙酰-CoA和CO。在缺氧條件下，癌細胞或其他高度增殖的細胞，糖酵解產生的大部分的丙酮酸離開線粒體，通過乳酸脫氫酶的作用產生乳酸。一項2019年發表的研究表明，乳酸脫氫酶B第162位絲氨酸磷酸化會顯著增加其將丙酮酸還原為乳酸的活性，解除了丙酮酸對底物的抑制作用，導致丙酮酸和NADH轉化為乳酸和NAD的顯著升高，從而促進腫瘤細胞的糖酵解和腫瘤生長。缺氧條件下，糖酵解產物乳酸可以激活癌細胞中許多信號通路，促進癌細胞的存活、侵襲、遷移、免疫逃逸和血管生成。乳酸脫氫酶的啟動子含有HIF-1α結合位點，缺氧條件能誘導乳酸脫氫酶的表達，相關研究表明RAC1是HIF-1激活所必需的。2020年發表的一項研究結果表明，激活RAC1可以通過上調糖酵解，特別是非氧化磷酸戊糖途徑，增加核苷酸代謝，引起乳腺癌細胞的化療耐藥；該研究提示，靶向RAC1是一種克服乳腺癌獲得性化療耐藥的潛在策略。2019年發表的一項研究表明，在有氧條件下，抑制RAC1活性會通過抑制AKT/FOXO3a的磷酸化，影響糖酵解的關鍵酶PKM、LDHA和HK1的表達，進一步影響細胞代謝重編程。深入研究腫瘤細胞的代謝重編程相關分子機制對腫瘤的靶向治療具有重要指導意義。

4 持續激活型RAC1與永久失活型RAC1

所謂的持續激活型RAC1，即RAC1蛋白能持續結合GTP，可持續向效應器發出信號產生激活效果，其經典的突變形式有RAC1V12，該突變型是RAC1蛋白的第12位氨基酸殘基由甘氨酸G突變為纈氨酸V，詳見圖3(自繪模式圖)，該位點突變后，可導致GAPs無法水解與RAC1結合的GTP，使RAC1處于持續的激活狀態。所謂的永久失活型RAC1，即RAC1蛋白無法與GTP結合，阻止RAC1與相應效應物結合發揮作用，阻斷該基因調控的信號轉導。其經典的突變形式有RAC1N17，該突變型是RAC1蛋白的第17位氨基酸殘基由蘇氨酸T突變為天冬酰胺N，詳見圖3，該位點突變后，可阻止RAC1與GTP結合，抑制RAC1蛋白向下游效應器發出信號產生失活的效果，RAC1V12和RAC1N17是對比研究RAC1蛋白功能最常用的工具。RAC1在多種腫瘤中廣泛存在著突變，激活型RAC1是驅動腫瘤惡性演進的重要因素。一項新近的研究闡述了RAC1在多種惡性腫瘤中存在的不同形式突變，在頭頸癌中發現RAC1C18Y/C18F突變，在結直腸癌中發現RAC1C18Y突變，在睪丸癌中發現RAC1G12V突變，在前列腺癌中發現RAC1Q61R突變，在黑色素瘤中發現RAC1P29S突變，這些常見的突變大多發生在RAC1蛋白的關鍵結構域上，通過影響RAC1蛋白中P-loop、開關Ⅰ、開關Ⅱ的結構，進而影響RAC1蛋白與GTP/GDP的結合。Zeiz等報道在人體內RAC1P29S激活型突變與惡性黑色素瘤的耐藥性和不良預后有關，該文提示，深入研究RAC1突變體調控細胞的分子機制，將有助于綜合考慮RAC1信號通路的上游與下游諸環節，為開展腫瘤的聯合分子靶向治療研究提供理論依據。

圖3 RAC1蛋白氨基酸殘基位點G12V和T17N突變示意圖

5 總結與展望

RAC1作為一個重要的小G蛋白，在腫瘤細胞通訊中發揮著重要的調控作用。RAC1通過對PAKs激酶、JNK級聯信號通路和糖酵解信號通路等通路中重要靶標分子的調控，影響腫瘤細胞的增殖、遷移和代謝，進一步影響腫瘤的發生與發展。深入研究RAC1在惡性腫瘤演進中的分子作用機制，可為以RAC1為靶點，開展惡性腫瘤分子靶向抑制劑開發提供理論依據；同時也可為以RAC1及其信號通路上下游的效應物環節為分子靶點，開展惡性腫瘤聯合分子靶向治療研究提供理論指導。