微小RNA-494-3p靶向配子生成素結合蛋白2促進結直腸癌細胞侵襲、遷移及上皮間質轉化的實驗研究

劉敏，吳運

配子生成素結合蛋白2（GGNBP2）也被稱為ZFP403，在乳腺癌（包括三陰性乳腺癌）、膠質瘤組織及卵巢癌組織和細胞中表達下調，過表達GGNBP2可抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲。微小RNA-494-3p（miR-494-3p）在肝細胞癌（HCC）組織表達上調并與HCC病人的預后不良和癌細胞轉移有關。miR-494-3p在人腦膠質瘤組織和鼻咽癌中表達上調，抑制miR-494-3p可抑制膠質瘤細胞的侵襲、增殖并促進細胞凋亡，抑制鼻咽癌細胞的遷移和侵襲。然而miR-494-3p和GGNBP2對結直腸癌發生發展的影響尚未可知。本研究于2019年1月至2019年12月以人結直腸上皮細胞NCM460為對照，首先檢測了結直腸癌細胞系T84、LS1034、HCT116中miR-494-3p和GGNBP2表達；然后以LS1034為研究對象，探討miR-494-3p能否靶向GGNBP2影響結直癌細胞侵襲、遷移及上皮間質轉化（EMT），以期為結直腸癌的治療提供新的分子靶標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人結直腸癌細胞株T84、LS1034、HCT116和人結腸上皮細胞株NCM460購自美國ATCC；胎牛血清（FBS）、DMEM/F-12培養基和RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司，牛血清白蛋白（BSA）、四基噻唑基四唑（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）和胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司；Transwell板購自美國Corning公司；miR-494-3p模擬物（mimics）和抑制劑（anit-miR-494-3p）、GGNBP2小干擾RNA（si-GGNBP2）和過表達載體（pcDNA-GGNBP2）、模擬對照序列（miR-con）、抑制劑陰性對照序列（anti-miR-con）、小干擾RNA陰性對照（si-con）、空載體（pcDNA-con）、GGNBP2野生型（WT-GGNBP2）和突變型（MUT-GGNBP2）熒光素酶報告載體購自上海吉瑪制藥有限公司；GGNBP2、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、磷酸化蛋白酪氨酸激酶2（pJak2）、磷酸化信號轉導和轉錄活化因子3（p-STAT3）及β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自英國Abcam公司；熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司；Lipofectamine 2000轉染試劑、RNA提取試劑TRIzol、real-time PCR試劑盒、反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；二喹啉甲酸蛋白（BCA）定量試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；顯微鏡、全自動酶標儀、發光儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和處理細胞培養：將人正常結直腸上皮細胞NCM460、人結直腸癌細胞LS1034和HCT116培養于含10%FBS的RPMI1640培養基中，人結直腸癌T84細胞培養于含5%FBS的DMEM/F-12培養基中，培養液均添加100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，將細胞置于37℃、5%二氧化碳培養箱中培養。細胞生長密度值90%時，消化傳代。

1.2.2 Real-time PCR檢測RNA的表達將對數期各細胞濃度調整為2.5×l0個/毫升，接種于6孔板中（每孔2.5 mL）。培養48 h后，棄培養基，用TRIzol試劑提取細胞中總RNA，反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板行PCR反應。反應程序為：95℃、1 min；95℃、40 s、57℃、30 s、72℃、45 s，35個循環；72℃、10 min。運用2方法進行數據分析。

1.2.3 細胞轉染將對數期LS1034細胞濃度調整為2.5×l0個/mL，接種于6孔板中（每孔2.5mL），培養24h后，棄培養基。利用Lipofectamine 2000試劑盒，將miR-con（miR-con組）、miR-494-3p mimics（miR-494-3p組）、anti-miR-con（anti-miR-con組）、anti-miR-494-3p（anti-miR-494-3p組）、pcDNA-con（pcDNA-con組）、pcDNA-GGNBP2（pcDNA-GGNBP2組）、anti-miR-494-3p與si-con（anti-miR-494-3p+sicon組）、anti-miR-494-3p與si-GGNBP2（anti-miR-494-3p+si-GGNBP2組）共轉染至LS1034細胞。轉染6 h后，換成完全培養基。再培養24 h，收集細胞進行驗證，驗證成功后進行后續實驗。

1.2.4 MTT實驗測定細胞活性將轉染后的各組LS1034細胞濃度調整至2.5×10個/毫升，接種于96孔板中（每孔200 μL）。同時設置對照（NC）組，接種未轉染的LS1034細胞。培養48 h時，加20 μL（5 mg/mL）MTT，孵育4 h。棄上清液，加150 μL DMSO，室溫振蕩5 min，酶標儀測定490 nm處吸光度（A）值。細胞存活率=（A-A）/（A-A）×100%。

1.2.5 Transwell實驗測定細胞遷移和侵襲遷移實驗：將LS1034細胞用無血清RPMI1640培養基稀釋為1×105個/毫升，取100 μL加至Transwell小室上室，另取500 μL含10%FBS的培養基加至下室。培養48 h，棄培養基。用甲醛固定細胞，并用結晶紫染色后，于顯微鏡觀察并計數，每個樣本計數10個視野，取平均值。

侵襲實驗：除預先在Transwell小室上室鋪用4℃無血清培養基1∶8比例稀釋的Matrigel基質膠外，剩余步驟與遷移實驗相同。

1.2.6 雙熒光素酶報告系統實驗將LS1034細胞以2.5×10個/孔接種于24孔板中，培養24 h，棄培養基。利用Lipofectamine 2000試劑盒，將WT-GGNBP2與miR-con或miR-494-3p mimics、MUT-GGNBP2與miR-con或miR-494-3p共 轉 染 至LS1034細胞。轉染6 h后，換為完全培養基。再培養24 h，棄培養基，加細胞裂解緩沖液裂解20 min。將裂解液離心（3 500 r/min、5 min），收集上清，加入熒光素酶底物，發光儀檢測上清中熒光素酶活性，結果以螢火蟲與海參的熒光強度比值表示。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達將細胞濃度調整為2.5×l0個/毫升，接種于6孔板中（每孔2.5 mL），細胞分組同1.2.3。培養48 h，棄培養基，加RIPA裂解液孵育20 min，超聲破碎細胞，收集蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取蛋白樣本進行SDS-PAGE，轉膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗（GGNBP2抗 體1∶800、Cyclin D1抗 體1∶1 000、MMP-2抗體1∶2 000、E-cadherin抗體1∶1 500、Vimentin抗體1∶1 000和β-actin抗體1∶2 000），4℃孵育過夜。洗膜后，加稀釋的酶標二抗，室溫孵育1 h。加化學發光試劑，避光顯影后，曝光拍照。以β-actin為內參照，分析目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 miR-494-3p和GGNBP2在結直腸癌細胞系中的表達

與正常結直腸上皮細胞NCM460相比，結直腸癌細胞系T84、LS1034和HCT116中miR-494-3p表達量顯著升高，GGNBP2 mRNA的表達量顯著下降，GGNBP2蛋白的表達量顯著低于NCM460細胞。由于LS1034細胞中miR-494-3p和GGNBP2表達較NCM460細胞差異最顯著，因此，選擇LS1034細胞進行后續實驗。見表1、圖1。

表1 結直腸癌細胞系中miR-494-3p和GGNBP2表達/±s

圖1 Western blot檢測結直腸癌細胞系中GGNBP2蛋白表達

2.2 抑制miR-

4

94-3p對結直腸癌細胞侵襲、遷移及EMT的影響

與anti-miR-con組相比，anti-miR-494-3p組LS1034細胞中miR-494-3p表達量顯著下降，細胞存活率、遷移數和侵襲數均顯著下降，細胞中Cyclin D1和MMP-2蛋白表達均下降，E-cadherin蛋白表達升高，Vimentin蛋白表達降低。NC組與anti-miR-con組各檢測指標比較均差異無統計學意義（

P

＞0.05）。見表2，3。

表2 抑制miR-494-3p對LS1034細胞活性、遷移和侵襲的影響/±s

2.3 過表達GGNBP2對LS1034細胞侵襲、遷移及EMT的影響

與pcDNA-con組相比，pcDNA-GGNBP2組LS1034細胞中GGNBP2蛋白表達量顯著上升，細胞存活率、遷移數和侵襲數均顯著下降，細胞中Cyclin D1和MMP-2蛋白表達均下降，E-cadherin蛋白表達升高，Vimentin蛋白表達降低。NC組與anti-miR-con組各檢測指標比較均差異無統計學意義（

P

＞0.05）。見表4，5。

表4 過表達GGNBP2對LS1034細胞活性、遷移和侵襲的影響/±s

2.4 miR-4

9

4-3p靶向GGNBP2并抑制GGNBP2蛋白的表達

通過生物信息學預測發現，GGNBP2的3’UTR區含有與miR-494-3p互補的核苷酸序列。雙熒光素酶報告系統結果顯示，與共轉染miR-con與WT-GGNBP2的LS1034的細胞比較，共轉染miR-494-3p與WT-GGNBP2的LS1034的細胞熒光素酶活 性 顯 著 下 降［（0.37±0.08）比（1.00±0.04），

P

＜0.001］，與 共 轉 染miR-con與MUT-GGNBP2的LS1034細胞比較，與共轉染miR-494-3pWT-GGNBP2的LS1034細胞熒光素酶活性沒有明顯變化［（0.91±0.11）比（0.95±0.06），

P

=0.480］。Western blot結果發現，與miR-con組相比，miR-494-3p組的GGNBP2蛋 白 表 達 量 顯 著 降 低［（0.34±0.09）比（1.00±0.06），

P

＜0.001］；與anti-miR-con組相比，antimiR-494-3p組的GGNBP2蛋白表達量顯著下降［（2.04±0.14）比（0.87±0.12），

P

＜0.001］。

表3 抑制miR-494-3p對LS1034細胞中Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin和Vimentin蛋白表達的影響/±s

2.5 沉默GGNBP2部分逆轉抑制miR-494-3p對結直腸癌細胞侵襲遷移及EMT影響

與anti-miR-494-3p+si-con組 相 比，anti-miR-494-3p+si-GGNBP2組GGNBP2蛋白表達量顯著降低，細胞存活率、遷移數和侵襲數均顯著上升，細胞中Cyclin D1和MMP-2蛋白表達均升高，E-cadherin蛋白表達下降，Vimentin蛋白表達升高。見表6，7。

表5 過表達GGNBP2對LS1034細胞中Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin和Vimentin蛋白表達的影響/±s

表6 沉默GGNBP2逆轉抑制miR-494-3p對LS1034細胞活性、遷移和侵襲的影響/±s

3 討論

結直腸癌的復發轉移是導致病人死亡的主要原因。研究表明，miRNA參與調控結直腸癌復發轉移，可作為結直腸癌治療的分子靶點。miR-494在多種癌組織中出現異常表達，有研究結果表明，在大多數癌癥中，miR-494的高表達可能預示著較好的總體生存率，而在結直腸癌和非小細胞肺癌中，過表達miR-494可能預示著較差的總體生存率。miR-494在結直腸癌組織和細胞系中表達上調，并通過靶向PTEN基因促進細胞遷移和侵襲。Zhang等也研究發現，miR-494在結直腸癌組織中表達水平顯著上調，其通過靶向腺瘤性結腸息肉病基因（APC）誘導Wnt/β-catenin信號通路，促進癌細胞的生長。本研究發現，抑制miR-494-3p表達可以抑制LS1034細胞存活、遷移和侵襲并抑制EMT。這與Zhang等結果一致，證實miR-494-3p促進結直腸癌的發展進程。

表7 沉默GGNBP2部分逆轉抑制miR-494-3p對LS1034細胞中Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin和Vimentin蛋白表達的影響/±s

生物信息學預測發現，GGNBP2的3’UTR序列中含有與miR-494-3p互補的序列，提示GGNBP2和miR-494-3p之間可能存在調控關系，GGNBP2可能參與miR-494-3p對結直腸癌的調控過程。GGNBP2（又稱ZNF403）是一種腫瘤抑制因子，與多種癌癥的增殖、遷移和侵襲有關，支持細胞的形態和功能，在精子發生過程起關鍵作用。有報道表明，GGNBP2在卵巢癌中的下調促進了卵巢癌的耐藥。在人細胞中敲除GGNBP2可影響細胞周期調控基因的表達譜，促進G2/M細胞周期的阻滯，p21蛋白上調，MCM2蛋白下調；在人喉癌細胞Hep-2中敲除GGNBP2具有抗癌作用，抑制癌細胞增殖和遷移。但GGNBP2在結直腸癌中表達和作用尚不清楚。本研究 發 現，GGNBP2結 直 腸 癌 細 胞T84、LS1034和HCT116中表達下調，過表達GGNBP2可抑制LS1034細胞存活、遷移和侵襲并抑制EMT，同樣說明過表達GGNBP2具有抑癌作用。雙熒光素酶報告系統結果顯示，miR-494-3p靶向負調控GGNBP2的表達，沉默GGNBP2表達可部分逆轉抑制miR-494-3p對LS1034細胞侵襲遷移和EMT的作用，說明miR-494-3p通過調控GGNBP2促進腫瘤發生和發展。

綜上，本研究闡述了在結直腸癌LS1034細胞中miR-494-3p通過靶向下調GGNBP2表達促進結直腸癌LS1034細胞遷移、侵襲和EMT，miR-494-3p/GGNBP2可能為結直腸癌的治療提供了潛在分子靶點。