牙種植體周圍黏膜炎齦溝液中低氧誘導因子-1α、基質金屬蛋白酶-2的水平及意義

李雋，尹霜霜，譚為聰，余留先

牙種植體周圍黏膜炎是發生在種植體周圍軟組織的可逆性炎癥，若治療不及時，會因炎癥進展迅速造成支持骨喪失，進一步發展為種植體周圍炎，導致種植體修復失敗。目前認為種植體周圍黏膜炎是由菌斑生物膜引發的炎癥反應、特異性免疫和非特異性免疫防御機制過程造成的疾病。低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1ɑ，HIF-1α）是低氧誘導因子-1的組成亞基之一，是低氧應激反應的關鍵轉錄調節因子，可激活宿主免疫反應，并與產生的基質金屬蛋白酶一同參與牙周組織的破壞、降解過程。基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）屬于底物為明膠及Ⅳ/Ⅴ型膠原的明膠酶類，可降解壞死組織的膠原纖維，并促進組織重建，參與牙周膜細胞外基質的降解及牙周組織更新過程。目前，種植體周圍黏膜炎齦溝液中HIF-1α、MMP-2的研究相對較少。因此本研究將通過檢測種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2的表達水平，探討兩者在種植體周圍黏膜炎發病機制中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年9月至2019年6月在湖南中醫藥高等專科學校附屬第一醫院收治的種植體周圍黏膜炎病人（黏膜炎組）46例作為研究對象，同時選取種植體周圍炎病人（周圍炎組）48例，同期種植體周圍牙齦健康者（健康組）50例。收集三組基線資料，包括性別、年齡、體質量指數（BMI），經統計學分析和比較，均差異無統計學意義（

P

＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 三組基線資料比較

種植體周圍黏膜炎病人納入標準：（1）種植體周圍探診有出血或溢膿但無骨組織吸收；（2）病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，并簽署紙質版知情同意書。排除標準：（1）有全身性疾病、種植體周圍其他疾病者；（2）3個月內有牙周組織疾病治療史或口服抗生素、免疫抑制劑、避孕類藥物者；（3）1個月內用抑制菌斑的藥物漱口或內服用抗菌類藥物者；（4）提取樣本期間處于月經期、妊娠期或哺乳期者；（5）依從性差、不能按時復診者；（6）有吸煙史者；（7）口腔衛生極差者。

種植體周圍炎判定標準：種植體周圍探診有出血或溢膿且有骨組織吸收。

1.2 試劑與儀器

人HIF-1α、MMP-2、白細胞介素-1β（IL-1β）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）酶聯免疫（ELISA）檢測試劑盒（貨號分別為YYSJH-1119、YYSJH-1277、YYSJH-139、YYSJH-974、YY-20174）購自上海優予生物科技有限公司；人核因子-κB（NF-κB）ELISA檢測試劑盒（貨號CD-103606-ELISA）購自武漢純度生物科技有限公司；酶標儀（型號MODEL550）購自美國Bio-Rad公司。

1.3 齦溝液標本的收集

制作2 mm×20 mm的濾紙條，高溫高壓消毒后備用。無菌干棉球拭干牙面，無菌棉卷隔濕，將消毒好的濾紙條輕輕插入，1 min后取出（有唾液或血液污染者棄掉重新取樣）。插入30 s后取出，每個種植體分別取頰（唇）側近遠中2個位點，取相同長度（2 mm）的濾紙條放入盛有200 μL PBS緩沖液的Eppendorf管中并震蕩30 min，在4℃低溫條件下10 000 r/min離心10 min，取上清液放入-70℃冰箱內備用。

1.4 齦溝液中HIF-1α、MMP-2、IL-1β、NF-κB、SOD、MDA表達水平檢測

從-70℃冰箱中取出備檢樣本在室溫下放置20 min，ELISA法檢測齦溝液中PTX3、IL-6、IL-10、TNF-α、NF-κB的表達水平，試驗方法均按照相應試劑盒說明書進行。使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度值，根據繪制的標準曲線計算HIF-1α、MMP-2、IL-1β、NF-κB、SOD、MDA的表達水平。

1.5 牙周檢查指標

（1）菌斑指數（plaque index，PLI）：根據菌斑堆積量分為4級，齦緣區無菌斑記為0分；視診無菌斑，但在游離齦及鄰近區可用探針可刮出薄層菌斑記為1分；游離齦區、鄰近牙面或齦袋內可見中等堆積量的軟性沉積物記為2分；游離齦區及鄰近牙面或齦袋內有大量軟性沉積物記為3分。（2）牙齦指數（gingival index，GI）：根據牙齦病變程度分為4級，牙齦正常記為0分；牙齦輕度炎癥，輕度水腫，顏色輕度改變，探診不出血記為1分；牙齦中度炎癥，水腫、顏色明顯發紅、有光亮，探診出血記為2分；牙齦炎癥明顯，紅腫，有自動出血、潰瘍傾向記為3分。（3）齦溝出血指數（sulcus bleeding index，SBI）：根據齦溝出血程度分為4級，齦溝不出血記為1分；輕探齦溝時出血，齦外觀正常記為2分；探齦溝時出血，牙齦變紅，無腫脹癥狀記為3分；牙齦有潰瘍或其他癥狀記為4分。（4）探診深度（probingdepth，PD）：以25 g左右的探診力量探測齦緣到牙周袋底或齦溝底的距離，每個種植體探診舌側近中、中央、遠中和頰近中、中央、遠中6個部位，取平均值記為PD值。所有檢測均由同一名醫生完成。

2 結果

2.

1

三組種植體周圍齦溝液中HIF-1ɑ、MMP-2水平

三組種植體周圍齦溝液中HIF-1ɑ、MMP-2水平均差異有統計學意義（

P

＜0.05）。與健康組相比，黏膜炎組、周圍炎組病人種植體周圍齦溝液中HIF-1ɑ、MMP-2水平明顯升高（

P

＜0.05）；與黏膜炎組相比，周圍炎組病人種植體周圍齦溝液中HIF-1ɑ、MMP-2水平明顯升高（

P

＜0.05）。見表2。

表2 三組種植體周圍齦溝液中HIF-1ɑ、MMP-2表達水平比較/（xˉ±s，μg/L）

2.2 三組種植體周圍齦溝液中IL-1β、NF-κB、SOD、MDA水平

三組種植體周圍齦溝液中IL-1β、NF-κB、SOD、MDA水平均差異有統計學意義（

P

＜0.05）。與健康組相比，黏膜炎組、周圍炎組病人種植體周圍齦溝液中IL-1β、NF-κB、MDA水平明顯升高（

P

＜0.05），SOD水平明顯降低（

P

＜0.05）；與黏膜炎組相比，周圍炎組病人種植體周圍齦溝液中IL-1β水平差異無統計學意義（

P

＞0.05），NF-κB、MDA水平明顯升高（

P

＜0.05），SOD水平明顯降低（

P

＜0.05）。見表3。

表3 三組種植體周圍齦溝液中IL-1β、NF-κB、SOD、MDA表達水平比較/（μg/L，±s）

2.3 三組PLI、GI、SBI、PD值

三組PLI、GI、SBI、PD值均差異有統計學意義（

P

＜0.05）。與健康組相比，黏膜炎組、周圍炎組病人PLI、GI、SBI、PD值明顯升高（

P

＜0.05）；與黏膜炎組相比，周圍炎組病人PLI、GI、SBI、PD值明顯升高（

P

＜0.05）。見表4。

表4 三組PLI、GI、SBI、PD值比較/±s

2.4 種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2水平與IL-1β、NF-κB、SOD、MDA的相關性分析

相關性分析結果顯示，種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2水平與IL-1β、NF-κB水平均明顯正相關（

P

＜0.05），與SOD水平均明顯負相關（

P

＜0.05），HIF-1α水平與MDA水平正相關不明顯（

P

＞0.05），MMP-2水平與MDA水平顯著正相關（

P

＜0.05）。見表5。

表5 HIF-1α、MMP-2水平與IL-1β、NF-κB、SOD、MDA的相關性分析

2.5 種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2水 平與PLI、GI、SBI、PD的 相關性 分析

相關性分析結果顯示，種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2水平與PLI、GI、SBI、PD值均明顯正相關（

P

＜0.05）。見表6。

表6 HIF-1α、MMP-2水平與PLI、GI、SBI、PD的相關性分析

2.6 種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2水平預測種植體周圍炎的效能分析

種植體周圍黏膜炎預測是否發展為種植體周圍炎，齦溝液中HIF-1α水 平的ROC曲 線下面 積為0.663（95%

CI

：0.554～0.773），截 斷 值 為527.88 μg/L，敏 感 度 為62.5%，特異性為65.2%；齦溝液中MMP-2水平的ROC曲線下面積為0.736（95%

CI

：0.637～0.836），截斷值為11.940 μg/L，敏感度為85.4%，特異性為52.2%；兩者聯合預測曲線下面積為0.799（95%

CI

：0.708～0.890），敏感度為68.8%，特異性為87.0%。見圖1。

圖1 齦溝液中HIF-1α、MMP-2水平的ROC曲線分析

3 討論

種植體周圍黏膜炎、周圍炎都是由菌斑引起的種植牙常見并發癥，其中，種植體周圍黏膜炎病變局限于種植體周圍的軟組織，具有可逆性，其發生過程伴隨著炎癥反應、氧化應激反應的發生；若病變繼續發展成周圍炎，會導致骨喪失，進而發生種植體松動脫落。據統計，種植體周圍黏膜炎發病率達83.6%，種植體周圍黏膜炎及其晚期表現周圍炎的發生是造成種植義齒修復失敗的主要原因，早期診斷并治療將有利于種植體長期穩定。所以，尋找預測種植體周圍黏膜炎發生發展的生物標志物，是及時采取治療、保證種植體長期穩定的關鍵。

HIF-1α是細胞進行低氧適應并調節應答的關鍵因子，對多種炎性因子均有促進作用，參與多種疾病的發病過程。有研究表明，牙周炎中HIF-1α的表達明顯高于正常病人，可能與牙周炎發生密切相關。王瑢等通過糾正牙周炎組織的缺氧狀態，降低HIF-1α平均陽性細胞率，達到了緩解牙周炎的目的。李坤陽等通過建立大鼠牙周炎模型，降低牙周炎HIF-1α陽性表達，減輕牙周炎癥程度，取得很好的治療效果。本研究結果表明，種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α水平明顯上調，與炎性因子IL-1β、NF-κB水平、反映疾病情況的PLI、GI、SBI、PD值明顯正相關，與氧化應激指標SOD水平明顯負相關，預后發展的ROC曲線下面積為0.663（95%

CI

：0.554～0.773），敏感度為62.5%，特異性為65.2%。提示種植體周圍黏膜炎齦溝液HIF-1α水平可能與疾病發生有關，且與炎性因子水平、氧化應激指標相關性明顯，可能通過炎癥、氧化應激共同影響疾病，且對預后種植體周圍黏膜炎發展具有一定價值。MMP-2是能降解細胞外基質的蛋白水解酶，常表達于成纖維細胞和破骨細胞中，其表達能通過炎癥早期釋放的炎癥介質誘導增加，并通過降解細胞外基質促進炎癥細胞的進一步浸潤，在牙周組織正常改建方面起重要作用。王雙雙研究表明，降低牙周炎病人齦溝液中IL-1β、TNF-ɑ和MMP-2的濃度能治療牙周炎。本研究結果顯示，種植體周圍黏膜炎齦溝液MMP-2表達水平明顯上調，與IL-1β、NF-κB、MDA水平、PLI、GI、SBI、PD值明顯正相關，與SOD水平明顯負相關，預后的ROC曲線下面積為0.736（95%

CI

：0.637～0.836），敏感度為85.4%，特異性為52.2%。這表明齦溝液MMP-2水平的升高可能與疾病發生發展有關，其作用機制可能與炎癥、氧化應激有關，預后種植體周圍黏膜炎發展的敏感度較高。研究發現，發生低氧、牙周炎時，HIF-1α可能通過調控MMP-2表達，參與血管生成、細胞遷移及傷口愈合等多種病理生理過程，在牙周組織發揮重要作用。本研究結果表明，齦溝液HIF-1α、MMP-2水平聯合檢測的ROC曲線下面積為0.799（95%

CI

：0.708～0.890），敏感度為68.8%，特異性為87.0%。提示與單因子預測疾病發展相比，兩者聯合預測能提高曲線下面積和特異性，對預后有更高的診斷價值。

綜上所述，種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2明顯高表達，與種植體周圍黏膜炎的發展程度密切相關，且與炎癥、氧化應激和種植體周指標關系密切，可能對種植體周圍黏膜炎預后具有重要意義。但本研究存在不足：樣本量較小，仍需進一步擴大樣本量。