乏氧環境對子宮肌瘤細胞增殖及自噬相關蛋白表達的影響

余自淑，田莉，陸靜，李濤

子宮肌瘤是女性生殖系統常見的良性腫瘤疾 病，病人發病率較高，多伴有子宮出血、腰背酸痛、流產、不孕等，嚴重影響了病人的生活質量。子宮動脈栓塞術（uterine artery embolization，UAE）治療子宮肌瘤在臨床上的應用表明，乏氧環境能夠誘發子宮肌瘤細胞的凋亡。在多種腫瘤中存在乏氧、低養分和pH的現象，腫瘤內乏氧促進一些轉錄因子活化，促進腫瘤細胞增殖，抑制細胞自噬，是腫瘤惡化轉移的重要因素。子宮肌瘤細胞中自噬作用存在明顯異常，自噬屬于細胞的一種凋亡方式，其與腫瘤的發生有著密切關系。因此，本研究對乏氧環境對子宮肌瘤細胞增殖及自噬相關蛋白表達的影響進行了探究，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取成都市第三人民醫院2017年11月至2018年11月收治的20例子宮肌瘤病人，年齡范圍32～53歲，年齡（38.2±2.7）歲，病人通過肌瘤切除術或腹腔鏡檢查獲得子宮肌瘤和周邊正常平滑肌組織樣本各2 g，迅速放置于無菌冰凍試管中，-80℃冰箱中保存待測，其中子宮肌瘤組織樣本作為觀察組，周邊正常平滑肌組織樣本作為對照組。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 納入及排除標準

納入標準：（1）術前常規行宮頸細胞學檢查診斷為子宮肌瘤；（2）均為首次發病病人；（3）所有病人均同意收集組織標本并簽署知情同意書；（4）均經腹腔鏡及病理檢查確診。

排除標準：（1）納入研究前6個月內未采用類固醇激素藥物；（2）惡性腫瘤病人；（3）合并子宮肌腺癥、肝腎功能異常、凝血功能障礙等病人。

1.3 方法

1.3.1 原代細胞培養將留取的子宮肌瘤組織和子宮平滑肌組織，采用含鏈霉素（1 000 μg/mL）和青霉素（1 000 U/mL）的平衡無機鹽溶液（hank's balanced salt solutions，HBSS）清洗3次，將組織剪碎，加入8 mL的0.4%膠原酶，于恒溫箱內37℃消化150 min。至小絮狀或肉眼不可見時，過濾、離心（以1 000 r／min，離心5 min，r=12 cm），收集細胞。隨后加入50 mL含10%FBS的DMEM-F12（100 μg/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素）重懸，5%二氧化碳及37℃條件下孵育培養。24 h后細胞貼壁進行換液，細胞融合達80%后采用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代，經3次純化后仍未貼壁的為子宮肌瘤細胞或子宮平滑肌細胞。

1.3.2 細胞增殖測定采用SRB染色法測定細胞增值率，將子宮肌瘤細胞和平滑肌細胞接種于96孔板上，3 000細胞/孔，于5%二氧化碳、1%氧氣培養箱中培養，分別于培養0 h、6 h、12 h、24 h及48 h取樣檢測細胞增值率。細胞增值率（%）=每階段實測細胞數/初始接種數×100%。

1.3.3 細胞凋亡檢測采用Annexin V/核酸染色測定。采用流式細胞分析儀（購自美國BD公司）檢測細胞凋亡情況，將第3代子宮肌瘤細胞和平滑肌細胞接種于6孔板上，得密度為6×10細胞/孔細胞懸液，經0.25%胰蛋白酶-EDTA酶化固定，經PBS洗2次，收集細胞。加入FITC標記的Annexin V室溫避光30 min，再加碘化丙啶（PI），避光反應5 min后，加入適量緩沖液（Buffer），上流式細胞儀進行檢測（具體步驟參照試劑盒說明書）。

1.3.4 增殖指標測定采用Western blotting法測定，將第3代子宮肌瘤細胞和平滑肌細胞接種于6孔板上，細胞培養值融合80%～90%，提取細胞總蛋白，并以25微克/孔凝膠電泳，將獲得的蛋白質電轉移至NC膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉，1 h后采用TBST反復漂洗3次，加入PR兔源多克隆抗體（1∶800），4℃條件下過夜，然后加入紅色熒光標記的二抗免疫球蛋白G（IgG）（1∶4 000），TBST漂洗，以β-肌動蛋白（βactin）為內參照，采用Odyssey熒光成像系統對各條帶吸光度值進行掃描分析，并計算子宮肌瘤細胞孕激素受體A/B（PR-A/B）、孕激素受體M（PR-M）、低氧誘導因子-1（HIF-1）及孔蛋白（porin）相對表達量。

1.3.5 自噬蛋白測定采用Western blotting檢測，取適量第3代子宮肌瘤細胞和平滑肌細胞樣本與液氮中研磨成粉后加入到磷酸酶及蛋白酶抑制劑裂解液中，離心取上清，定量變性，將獲得的蛋白質電泳、轉膜、封閉，隨后分別加入一抗及二抗孵育，熒光成像系統掃描分析，并測定程序性死亡受體-1（programmed cell death-1，PD-1）、酵母自噬相關基因（Beclin-1）、選擇性自噬接頭蛋白（P62）及微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ（microtubule associated protein light chain 3-1Ⅱ，LC3-Ⅱ）相對表達量。

2 結果

2.1 兩組不同時間點細胞增值率比較

隨著時間增加，兩組細胞增值率均顯著下降（

P

＜0.05）。培養0 h及6 h，兩組細胞增值率比較差異無統計學意義（

P

＞0.05）；培養12 h開始至48 h，兩組細胞增值率明顯降低，且觀察組細胞增值率更低于對照組（

P

＜0.05），見表1。

表1 兩組不同時間點細胞增值率比較/x±s

2.2 兩組不同時間點細胞凋亡率比較

隨著時間增加，兩組細胞凋亡率不斷增加（

P

＜0.05）；且6 h、12 h、24 h、48 h觀察組細胞凋亡率均顯著高于對照組（

P

＜0.05），見表2。

表2 兩組不同時間點細胞凋亡率比較/（%，x±s）

2.3 兩組PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin蛋白表達比較

培養0 h，觀察組PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin蛋白表達均顯著高于對照組（

P

＜0.05）；培養48 h后，觀察組PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05），而對照組各蛋白水平無明顯變化（

P

＞0.05），見表3。

表3 兩組PR-A/B、PR-M及porin蛋白相對表達量比較/x±s

2.4 兩組Beclin-1、P62及LC3-Ⅱ蛋白表達情況比較

培養0 h，觀察組Beclin-1、P62及LC3-Ⅱ水平均顯著低于對照組（

P

＜0.05）；培養48 h，觀察組觀察組各蛋白水平明顯升高（

P

＜0.05），而觀察組無明顯變化（

P

＞0.05）。見表4。

表4 兩組Beclin-1、P62及LC3-Ⅱ蛋白相對表達量比較/x±s

3 討論

子宮肌瘤是一種危害較大的婦科良性腫瘤，臨床研究發現，UAE術通過阻斷子宮動脈，使子宮肌瘤細胞處于缺氧、缺血狀態，促使肌瘤細胞凋亡。本研究探究了乏氧環境對子宮肌瘤細胞增殖和凋亡的影響。結果發現，隨著時間增加，兩組細胞增值率均顯著下降（

P

＜0.05）。培養0 h及6 h，兩組細胞增值率比較差異無統計學意義（

P

＞0.05）；培養12 h開始至48 h，觀察組細胞增值率低于對照組（

P

＜0.05）。隨著時間增加，兩組細胞凋亡比例不斷增加（

P

＜0.05）；且6 h、12 h、24 h、48 h觀察組細胞凋亡比例均顯著高于對照組（

P

＜0.05）。提示，乏氧環境明顯抑制了子宮肌瘤細胞的增殖并促進了子宮肌瘤細胞的凋亡。這也說明，子宮肌瘤組織對于缺氧條件更加敏感，其生長更容易受到抑制。孕激素受體和porin是子宮肌瘤重要的預測和預后因子，其表達水平與子宮肌瘤病人治療效果和預后密切相關，孕激素受體是配體激活核轉錄因子超家族的一員，孕激素受體A和B在子宮肌瘤細胞中的表達水平明顯高于周邊正常組織，并與孕激素受體M的作用有著密切關系，孕激素受體M能夠抑制子宮平滑肌細胞、乳腺癌細胞等的凋亡，在子宮肌瘤的生長中發揮著促進作用，PR-M與孕激素結合能夠促進平滑肌細胞MMP升高，促使細胞代謝及呼吸作用增強，抑制細胞凋亡，促進細胞異常增殖。HIF-1是介導細胞低氧反應的關鍵核轉錄因子，能夠調控細胞增殖而參與子宮肌瘤的發生與發展，其存在α和β兩個亞基，以α亞基活性最強，HIF-1α是修復細胞氧內環境和誘導乏氧基因的核心調節因子，在腫瘤壞死區表達顯著增高，并具有促進腫瘤轉移和侵襲、降低放化療敏感性等效應，已經成為腫瘤治療的重要靶點。Porin能夠誘導細胞代謝及凋亡，通過研究PR-A/B、PR-M及porin在乏氧環境下子宮肌瘤細胞中的變化可以了解乏氧環境對子宮肌瘤細胞增殖、凋亡的影響作用。本研究結果顯示，子宮肌瘤細胞中PR-A/B、PR-M及porin蛋白表達均顯著高于子宮平滑肌細胞。提示，子宮肌瘤細胞中PR-A/B、PR-M及porin表達異常活躍，而通過乏氧處理，觀察組PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05），而對照組各蛋白水平無明顯變化（

P

＞0.05）。提示，乏氧處理顯著降低了子宮肌瘤細胞中PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin表達水平，側面反映了乏氧處理抑制了子宮肌瘤細胞的增殖，研究認為，缺氧條件促使肌瘤細胞線粒體內源性凋亡程序啟動，線粒體在鈣離子、Bcl-2等蛋白的調控下釋放Cytc等分子激活caspases級聯反應，導致細胞凋亡。因此，乏氧環境能夠通過促進線粒體凋亡減少子宮肌瘤細胞中PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin蛋白表達，從而促進細胞凋亡。而乏氧對子宮平滑肌細胞作用不明顯，原因可能是子宮平滑肌細胞PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin水平原本就較低術后，受抑制不明顯。

子宮肌瘤細胞凋亡明顯降低，這也說明細胞正常凋亡能夠抑制子宮肌瘤的形成。凋亡為機體細胞的程序性死亡，是機體維持內環境穩定，清除受損細胞的重要方式；當程序性死亡過程被破壞，受損或基因變異時，細胞會繼續復制，導致腫瘤的發生。自噬是細胞的溶酶體降解途徑，細胞通過囊泡包裹受損細胞器及部分胞漿并運送至溶酶體分解，形成的多數大分子產物得以被重新利用。自噬作用即細胞Ⅱ型程序性死亡，其參與了機體生長、代謝和發育的多個過程，對于維持細胞內環境穩定和抑制腫瘤的產生有著重要的作用。Beclin-1、P62及LC3-Ⅱ是自噬的標志性蛋白，其水平變化反映了自噬能力的增強或減弱。Beclin-1能夠與PI3KC3相互作用促進自噬體形成，Beclin-1失活會促進缺氧誘導的血管形成。LC3-Ⅱ是自噬作用的標志分子，當自噬形體形成時，胞質型LC3會酶解形成LC3-Ⅱ。p62是一種多結構域的自噬底物連接蛋白，其能與待降解蛋白結合并運送至噬泡中降解，正常機體中，p62蛋白隨著自噬過程而逐漸降解，其與自噬體和溶酶體數量有著顯著正相關性。自噬和凋亡都是細胞程序性死亡的正常方式，腫瘤細胞中程序性死亡受抑制，自噬也會受到抑制，而乏氧條件下能夠促進腫瘤細胞凋亡，其與腫瘤細胞乏氧狀態下自噬作用重新激活可能存在密切關系。本研究發現，子宮肌瘤細胞中Beclin-1、P62及LC3-Ⅱ水平均顯著低于子宮平滑肌細胞，提示子宮肌瘤細胞自噬作用明顯受限。而通過乏氧處理，子宮肌瘤細胞中Beclin-1、P62及LC3-Ⅱ水平明顯增加，促使自噬體生成速度增加，并提升溶酶體降解速度，增加自噬體蓄積。提示乏氧處理能夠增強子宮肌瘤細胞自噬作用，進而發揮溶酶體的降解作用，促進子宮肌瘤細胞的降解凋亡。

乏氧環境對于子宮肌瘤細胞的影響及機制尚需要進一步研究，對于乏氧環境對子宮肌瘤細胞增殖和自噬相關蛋白的影響可以為子宮肌瘤的治療提供理論依據。但除此之外，其中還可能存在其他因素，對于乏氧環境下子宮肌瘤細胞和子宮平滑肌細胞的變化還需繼續深入了解。