內質網應激相關蛋白1過表達對缺氧/復氧誘導的H9c2心肌細胞凋亡的影響

蘇長英，孟艷紅，吳美齡

經皮冠狀動脈介入治療心肌梗死雖然取得一定成效，但可造成心肌缺血再灌注損傷，并發心律失常、心力衰竭等嚴重后果。研究發現，心肌細胞凋亡和氧化損傷等與缺血再灌注損傷密切相關。內質網應激是體內氧化應激最重要的形式之一，可參與各種糖尿病心肌病、阿爾茲海默病等疾病及嚴重并發癥的發生。內質網應激相關蛋白1（SERP1）是一種可緩解內質網應激損害的未折疊蛋白應答反應的重要伴侶蛋白，可在內質網應激導致的組織細胞凋亡及自噬中發揮重要緩解作用。然而目前關于SERP1對心肌細胞的影響尚鮮有研究，因此，2018年1—12月進行本研究，擬通過過表達SERP1基因后探究其與缺氧/復氧（Hypoxia reoxygenation anoxia/reoxygenation，H/R）誘導的大鼠H9c2心肌細胞凋亡的緩解作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠H9c2心肌細胞系來自中國科學院上海細胞庫；本研究符合一般動物實驗倫理學原則。無糖DMEM培養基（貨號11966-025）、胎牛血清（FBS，貨號10099141）均購自美國Gibco；pCMV6-網應激相關蛋白1（pCMV6-SERP1）過表達質粒、pCMV6空載質粒（美國Origene公司）、Trizol試劑（貨號R0016）、蛋白抽提試劑盒（批次P0028）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（批次P0010S）、甲基噻唑藍（MTT）試劑盒（批次C0009）、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（批次C1062S）購自上海碧云天有限公司；PrimeScript?RT reagent Kit（Perfect Real Time）（編號RR037A）、TB GreenPremix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（編號RR820A）購自TaKaRa生物公司；引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成；半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）活性檢測試劑盒（貨號CASP3F）購自美國Sigma；Lipofectamine2000轉染試劑盒（貨號11668-0.75mL）、鼠源一抗三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（貨號AM4300）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）（貨號13-8800）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）（貨號MA5-13994），一抗兔源內質網應激相關蛋白1（SERP1）（貨號PA5-21385）、二抗羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）（貨號A-11001）、羊抗兔IgG（貨號A-11008）均購自美國Invitrogen；紫外分光光度計（美國Thermo公司）、FC酶標儀、Forma Steri-Cycle i160 5%二氧化碳培養箱購自美國Thermo Fisher；FACS CantoⅡ流式細胞儀購自美國BD；IX73倒置顯微鏡購自日本Olympus等。

1.2 方法

1.2.1 H9c2心肌細胞培養及H/R細胞模型建立采用含有10%FBS、1%青鏈霉素DMEM細胞培養液于37℃5%二氧化碳培養箱培養正常培養H9c2心肌細胞，設為正常對照組（NC組）。細胞傳代時用0.05%胰蛋白酶消化。待細胞匯合度約80%，棄去原培養基，加入無血清DMEM培養基，于37℃、5%二氧化碳、95%氮氣的缺氧培養箱中培養4 h，之后于37℃5%二氧化碳空氣培養箱中培養4 h，即為H/R H9c2心肌細胞模型，設為H/R組。

1.2.2 細胞轉染將H/R H9c2心肌細胞傳代于6孔細胞培養板中，每孔約1×10個細胞，待細胞匯合度約50%～60%進行細胞轉染。①Lipofectamine2000+Opti-MEM培養基混合均勻后室溫孵育5 min；②Lipofectamine2000+pCMV6/pCMV6-SERP1分別混勻后室溫孵育5 min；③將①分別與②中試劑等量混勻后室溫孵育20 min后，逐滴加入H/R H9c2心肌細胞中，分別設為H/R+pCMV6組和H/R+pCMV6-SERP1組，分組6個重復，以保證結果的可靠性。

1.2.3 H9c2心肌細胞SERP1mRNA水平檢測采用Trizol提取各組H9c2心肌細胞總RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度。反轉錄得到cDNA，置于-20℃保存備用。采用（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測SERP1mRNA表達水平。RT-qPCR采用20 μL反應體系：TB Green Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL，ROX Reference Dye or DyeⅡ（50×）0.4 μL，cDNA（50 ng/μL）2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，雙蒸水6.0 μL。反應采用兩步法，條件設置為：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s，40個循環；添加溶解曲線。SERP1 mRNA：正向引物（5′→3′）CTGAAGAGAACGAGCGGCTCAAG；反向引物（5′→3′）GACAGGAGGTGATGCCAACAGTTC。內參GAPDH：正向引物（5′→3′）GTCGATGGCTAGTCGTAGCATCGAT；反向 引 物（5′→3′）TGCTAGCTGGCATGCCCGATCGATC。采 用2法 各 組H9c2心 肌 細 胞 中SERP1mRNA的相對表達水平進行定量分析。

1.2.4 H9c2心肌細胞SERP1、Bax、Bcl-2蛋白水平檢測提取各組H9c2心肌細胞總蛋白，嚴格按照蛋白提取試劑盒操作說明書進行，蛋白濃度采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行測定，提取的蛋白置于-80℃保存備用。加入1/5體積6×SDS上樣緩沖液，95℃、5 min，冷卻離心后置于-20℃保存備用。取60 μg蛋白樣品，以GAPDH為內參，采用6%SDS-PAGE膠進行電泳。濕轉法將膠上蛋白轉移至NC膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋，加一抗（Bcl-2抗體1∶500；Bax抗體1∶500；SERP1抗體1∶500；GAPDH抗體1∶500）4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次20 min，用適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗IgG（1∶5 000）室溫孵育2 h，按上述方法洗膜，顯色，曝片，觀察并分析結果。

1.2.5 H9c2心肌細胞存活率檢測將NC組、H/R組、H/R+pCMV6組、H/R+pCMV6-SERP1組細胞接種于96孔板，每孔約0.5×10個/孔，每孔添加培養液200 μL。培養結束后用MTT試劑盒檢測各孔細胞增殖情況，具體操作嚴格按照說明書進行。細胞存活率=（OD/OD）×100%。

1.2.6 H9c2心肌細胞凋亡情況檢測取各組生長至對數期的H9c2心肌細胞以2×10個/孔接種于6孔細胞培養板中，待細胞融合至80%。培養48 h后每孔500 μL結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加5 μL PI，避光輕輕振蕩混勻，室溫放置15 min。同時設置陰性對照（無Annexin VFITC和PI），放入流式細胞儀檢測H9c2心肌細胞凋亡情況，并計算細胞凋亡率。

2 結果

2.1 各組H9c2心肌細胞中SERP1 mRNA及蛋白水平比較

與NC組比較，H/R組、H/R+pCMV6組H9c2心肌細胞SERP1 mRNA及蛋白表達水平顯著降低，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞SERP1 mRNA及蛋白表達水平顯著增加（

P

＜0.05），與H/R組、H/R+pCMV6組 比 較，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞中SERP1 mRNA及蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05）。詳見表1，圖1。

圖1 免疫印跡法檢測H9c2心肌細胞中SERP1蛋白表達

表1 各組H9c2心肌細胞中SERP1 mRNA水平比較/±s

2.2 各組H9c2心肌細胞存活率比較

與NC組［（100.00±00.00）%］比較，H/R組［（49.86±5.14）%］、H/R+pCMV6組［（48.75±5.23）%］、H/R+pCMV6-SERP1組［（89.72±8.61）%］H9c2心肌細胞存活率顯著降低（

P

＜0.05），與H/R組、H/R+pCMV6組比較，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞中存活率顯著升高（

P

＜0.05）。

2.3 各組H9c2心肌細胞凋亡率比較

與NC組［（4.45±0.62）%］比較，H/R組［（35.84±4.13）%］、H/R+pCMV6組［（33.66±4.07）%］、H/R+pCMV6-SERP1組［（10.96±1.74）%］H9c2心肌細胞凋亡率顯著增加（

P

＜0.05），與H/R組、H/R+pCMV6組比較，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞凋亡率顯著降低（

P

＜0.05）。

2.4 各組H9c2心肌細胞中凋亡相關蛋白檢測

與NC組比較，H/R組、H/R+pCMV6組、H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞Bcl-2相關X蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05），與H/R組、H/R+pCMV6組比較，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞中Bcl-2蛋白水平顯著升高，Bax、Caspase-3蛋白表達水平降低（

P

＜0.05）。詳見表2，圖2。

圖2 免疫印跡法檢測H9c2心肌細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達

表2 各組H9c2心肌細胞中SERP1 mRNA水平比較/±s

3 討論

本研究發現，與NC組比較，H/R組、H/R+pCMV6組H9c2心肌細胞SERP1 mRNA及蛋白表達水平顯著降低，與H/R組、H/R+pCMV6組比較，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞中SERP1 mRNA及蛋白水平升高，且比NC組高2倍多，提示H/R可抑制SERP1表達，轉染pCMV6-SERP1質粒后，SERP1過表達成功，可用于下游試驗。

H/R誘導的心肌損傷是一種復雜的病理生理過程，多伴隨心肌細胞壞死、凋亡及自噬，心肌細胞生存率降低和凋亡率增加是心肌損傷、心肌梗死病理性心肌重塑、心力衰竭等疾病發生的重要機制。內質網是多種重要細胞蛋白合成折疊和裝配的中心場所，高糖或缺氧等狀態會引發內質網應激（ESR），持續ESR會導致內質網功能受損，促進細胞凋亡。馮麗帥等研究報道，SERP1過表達可抑制過氧化氫引起的內皮細胞凋亡，促進氧化應激狀態下血管內皮細胞增殖修復。劉岳等研究報道，SERP1過表達可以抑制lncRNA CDKN2B-AS1表達，并進一步導致酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）和信號轉異子與激活子3（STAT3）磷酸化水平增強，內質網應激標志蛋白葡萄糖調節蛋白78（GRP78）與C/EBP環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白（CHOP）表達降低，減少糖氧剝奪導致的心肌細胞凋亡。Shang等研究報道，SERP1與心肌缺血再灌注損傷密切相關，SERP1過表達可通過激活JAK2/STAT3通路減少H/R誘導的H9c2心肌細胞凋亡。本研究結果發現，與NC組比較，H/R組、H/R+pCMV6組、H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞存活率降低、凋亡率增加，但與H/R組、H/R+pCMV6組比較，SERP1過表達組H9c2心肌細胞中存活率升高、凋亡率又降低，提示H/R處理可能促進H9c2心肌細胞凋亡，SERP1過表達后可促進H9c2心肌細胞增殖修復，抑制其凋亡，與文獻報道一致。

研究發現，紅細胞沉降率（ESR）與肌醇需求酶a/c-Jun氨基末端激酶（IREa/JNK）通路、肌醇需求酶1a/c-Jun氨基末端激酶（IRE1a/JNK）通路和半胱氨酸蛋白酶-12（caspase-12）級聯反應等多種信號通路有關，其中肌醇需求酶1a（IRE1a）通過腫瘤壞死因子受體相關因子2（TRAF2）調節p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和細胞外信號調節激酶通路（ERK），進而介導c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化促進細胞凋亡。ESR反應中促凋亡信號caspase-12和內質網應激相關CHOP蛋白表達量顯著增加，被激活的caspase-12從內質網進入細胞液中直接或間接激活caspase-3引起細胞凋亡，pERK持續激活還可促進凋亡蛋白轉錄激活因子-3（ATF-3）、C/EBP同源蛋白（CHOP），抑制B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）蛋白表達，發揮促凋亡作用。Bcl-2、Bax是重要的細胞凋亡相關基因，二者同屬于Bcl-2家族，Bax卻是一種促凋亡蛋白與Bcl-2功能相反，另Bcl-2又可通過抑制Caspase-3抑制細胞凋亡。郭紅雨等研究報道，缺氧/復氧H9c2心肌細胞中脯氨酰異構酶1沉默后細胞凋亡率降低，其中Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低，Bcl-2/Bax升高，Caspase-3蛋白水平降低。任安立等研究報道，沉默程序化細胞死亡因子5可通過促進Bax、抑制Bcl-2蛋白表達保護H9c2心肌細胞因H/R損傷誘導的凋亡和自噬。本研究結果發現，與NC組比較，H/R組、H/R+pCMV6組、H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心 肌 細 胞Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，與H/R組、H/R+pCMV6組比較，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞中Bcl-2蛋白水平顯著升高，Bax、Caspase-3蛋白表達水平降低，提示SERP1過表達可能通過上調Bcl-2蛋白，下調Bax、Caspase-3蛋白發揮抑制H9c2心肌細胞凋亡作用，但具體通路還有待進一步研究。

綜上所述，SERP1過表達可能通過上調Bcl-2蛋白，下調Bax、Caspase-3蛋白促進H9c2心肌細胞增殖修復，抑制其凋亡，發揮心肌保護作用，但應具體通路及調控機制還有待進一步深入探究。