草魚NCCRP-1和IL-10的表達、抗體制備及組織病理變化

陳靜妮，代禮平，雷 燕，胡海浩，黃鑒濤，簡紀常，閆秀英

（1.廣東海洋大學水產學院，廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室/水產經濟動物病害控制廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524088;2.廣州利洋水產科技股份有限公司，廣東 廣州 510515）

先天性免疫應答是宿主防御病毒感染的第一道屏障，并可激起宿主的獲得性免疫反應[1]。在魚類抗病毒感染的主要免疫應答中，細胞免疫起重要作用。魚類免疫細胞包括非特異性細胞毒性細胞（nonspecific cytotoxic cell,NCC）、淋巴細胞和吞噬細胞等。魚類NCC 的功能與哺乳動物自然殺傷（natural killer,NK）細胞相似。通過裂解病毒感染的細胞、寄生蟲、腫瘤靶細胞等，NCC 在魚體免疫反應中有重要作用[2]。非特異性細胞毒性細胞受體蛋白-1（non-specific cytotoxic cell receptor protein 1，NCCRP-1）是NCC 發揮功能的分子基礎。有些魚類的NCCRP-1 是一種典型的Ⅲ型膜蛋白，有的是可溶性蛋白[3]。NCCRP-1 對NCC 的激活有識別、結合靶細胞，激活JAK/STAT 信號通路[7-8]等多重作用[4-6]，因而在硬骨魚NCC 免疫反應中扮演重要角色[2,9]。在草魚（Ctenopharyngodon idella）抗呼腸孤病毒（GCRV）感染中，腎臟是重要免疫器官，草魚NCCRP-1 參與了免疫反應[3]。

白細胞介素-10（interleukin 10,IL-10）是一種主要的抗炎因子，可抑制單核細胞、巨噬細胞等釋放炎癥介質，并可增強抗炎性因子釋放，有下調炎癥反應等作用[10]，魚類單核細胞、T 細胞、巨噬細胞等多種細胞可產生IL-10。在人類、動物、魚類等均已發現，IL-10 在疾病中起重要作用[11-13]；IL-10可參與病毒致病過程[14-20]。魚類IL-10 參與免疫調節，在鯉（Cyprinus carpio）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、斑馬魚（Danio rerio）等頭腎中的表達量最高[21-22]，在卡特拉鲃（Catla catla）各組織均有不同程度的表達，感染后2 d 達到表達高峰[23]。

為探索細胞免疫在草魚抗病毒感染中的作用，本研究對草魚NCCRP-1和IL-10進行原核表達，制備其多克隆抗體，探討在重組NCCRP-1 和IL-10 免疫后，草魚腎臟和腸[3,24]組織病理學變化及NCCRP-1和IL-10 的表達，為開發草魚出血病新型基因工程疫苗、新型免疫佐劑及免疫治療等奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

載體pMD18-T，原核表達載體pET-32a，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21 購自TaKaRa 公司。成年新西蘭兔，2～ 5 kg/只，購自廣東醫科大學實驗動物中心（實驗動物質量合格證：0001906），按常規方法喂以飼料、胡蘿卜和青菜。草魚200 尾（約250 g），取自廣東省湛江市鶴地水庫，隨機取目測健康的草魚10 尾，經顯微鏡、PCR 和RT-PCR 等檢測無任何病原體和疾病癥狀，認為實驗魚健康。實驗魚于水箱26 ℃下暫養2 周，水體溶解氧、氨、氮和pH 分別是8.1 mg/L、0.1 mg/L、0.03 mg/L 和7.5。

1.2 草魚NCCRP-1 和IL-10 的原核表達與純化

根據本課題組前期獲得的草魚NCCRP-1和IL-10基因序列（GenBank 登錄號為HQ388293 和HQ388294）[3]，設計含酶切位點的引物（表1），用于擴增NCCRP-1和IL-10的ORF。取草魚腎臟組織，提取基因組DNA，用PCR 技術獲得草魚NCCRP-1和IL-10的ORF。PCR 擴增體系25 μL，含DNA 模板2 μL、10 μmol/L 引物各1 μL、dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL、10×ExTaqBuffer 2.5 μL、ExTaq酶 (1 U/μL) 0.25 μL、ddH2O 16.25 μL。草魚NCCRP-1ORF 擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s、57 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，30 個循環；72 ℃下延伸10 min，4 ℃條件下保存。草魚IL-10ORF 擴增條件除退火溫度為52 ℃外，其余同NCCRP-1。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

原核表達方法參照文獻[25]，將草魚NCCRP-1和IL-10的ORF（含酶切位點）插入pET-32a(+)載體（含his 標簽），通過菌落PCR、雙酶切（BamH I 和SalI）和測序確定正確構建原核表達質粒pET-NCCRP 和pET-IL10。

將重組表達質粒pET-NCCRP 和pET-IL10 分別轉入大腸桿菌BL21，挑取生長良好的單菌落接入含50 μg/mL 氨芐的LB 液體培養基，在37 ℃、200 r/min 條件振蕩培養12 h，按體積比1∶100 的比例接種到新配制的LB 液體培養基（含氨芐）中，在37 ℃下培養至D(600 nm) 達0.4～ 0.6，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為1 mmol/L，在37 ℃下振蕩培養4 h，以10 000 r/min離心 2 min，收集菌體，通過聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳檢測蛋白表達情況，并進一步優化重組融合蛋白NCCRP-1 和IL-10 的表達條件。

將含重組表達質粒（pET-NCCRP 和pET-IL10）的BL21 菌分別接種于200 mL LB 液體培養基（含氨芐）中，經最優誘導條件誘導，經過多重離心和重懸，用8 mol/L 尿素在4 ℃下溶解表達的重組蛋白。將獲得的重組蛋白用HisTrap HP 柱按常規方法純化，分別用30、60、90、120、150、200、250 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，收集逐步洗脫后的融合蛋白，然后進行SDS-PAGE 電泳和轉膜，用含50 g/L脫脂牛奶和質量分數0.1%吐溫的硫酸鹽緩沖液（PBS）室溫下阻斷1 h，用抗-His 鼠抗（1∶1 000，Invitrogen）4 ℃下孵育16 h，再用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體（1∶3 000，Takara）孵育2 h，曝光顯影。按照Bradford 蛋白質定量測定試劑盒（上海生工生物工程有限公司，貨號C503031）測定蛋白濃度。

1.3 兔抗草魚NCCRP-1 和兔抗草魚IL-10 多克隆抗體的制備及其效價測定

兔抗血清的制備參考文獻[25]，陰性對照血清取自未免疫兔。分別將純化后的重組NCCRP-1和IL-10蛋白 (500 μg) 與完全弗氏佐劑 (Sigma) 混勻呈乳狀，在兔后背采用多點注射法將此乳化混合物注入體內。第1 次免疫2 周后，每兩周加強免疫1 次，共進行4 次加強免疫。最后1 次加強免疫后8 d，抽取兔子血液，用辛酸-硫酸銨法純化血清[26]，儲存在-20 ℃冰箱備用。用ELISA 方法[25]測定兔抗血清滴度，并采用Western blot[25]檢測抗原抗體結合特異性。

1.4 草魚免疫、攻毒和樣品準備

將暫養的實驗魚分為4 組，每組30 尾，其他草魚備用。對照組1：不進行免疫和攻毒；實驗組1：每尾注射200 μL 免疫混合液1（含24 μg 重組NCCRP-1 的質量分數0.7%生理鹽水與弗氏完全佐劑體積比為4∶1）；實驗組2：每尾注射200 μL 免疫混合液2（含24 μg 重組IL-10 的質量分數0.7%生理鹽水與弗氏完全佐劑體積比4∶1）；對照組2：每尾注射200 μL 佐劑混合液（質量分數0.7%生理鹽水與弗氏完全佐劑體積比4∶1）。免疫后24 h 用約2 000 μg/mL GCRV GD108 對實驗組1、實驗組2 和對照組2 進行攻毒感染，劑量為150 μL/尾[25]。感染7 d 后，每組隨機取草魚3 尾，分別剖取腎臟和腸道組織，進行定量PCR、Western blot 和病理切片制作。

1.5 定量PCR 和Western blot

將3 尾草魚部分腎臟和腸道組織分別混合，提取RNA，進行定量PCR，重復3 次。定量PCR 內參基因為β-actin和GAPDH，引物為actinF、actinR、GAPDHF 和GAPDHR（表1）。目的基因NCCRP-1和IL-10的定量PCR 引物為NCCRPF、NCCRPR、IL-10F 和IL-10R（表1）。定量PCR 體系（25 μL）：SYBR?Premix ExTaqTM12.5 μL，每條引物0.5 μL(10 pmol/L)，cDNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL。反應條件：95 ℃ 3 min，然后95 ℃ 10 s、55 ℃（IL-10，54 ℃）30 s，40 個循環。用2-ΔΔCt法[27]處理定量PCR 數據，進行配對t檢驗，用SPSS15.0 軟件對數據進行統計分析，P＜ 0.05 時有顯著差異。

用預冷的質量分數0.7%生理鹽水快速洗滌摘取的部分腎臟和腸道組織，快速放入液氮，然后于冰上進行超聲勻漿（避免起泡），勻漿時加入預冷的生理鹽水4.5 mL。組織勻漿中迅速加入預冷的100 μL 尿素緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；8 mol/L 尿素）和1 μL 蛋白酶抑制劑PMSF，反復吹打，細胞充分裂解后以4 ℃、12 000g條件離心10 min，收集上清液保存于-80 ℃。采用Bradford蛋白質定量測定試劑盒測定總蛋白濃度，確保SDS-PAGE 電泳上樣蛋白總量一致。對腎臟和腸道中的NCCRP-1 和IL-10 進行Western blot 檢測[25]，一抗為上述的抗血清和兔抗GAPDH（1∶5 000，Thermo Fisher，上海），二抗為山羊抗兔（1∶30 000，Takara，大連）。孵育抗體時先進行目的蛋白的抗體孵育、顯色和檢測，然后使用Strip 緩沖液洗去膜上抗體，再進行內參蛋白GAPDH 的抗體孵育、顯色和檢測。

1.6 組織病理切片制作

分別取草魚部分腎臟和腸道組織，用質量分數0.7%的生理鹽水清洗，于Bouin 氏固定液中固定8 h，用流水洗去固定液。使用不同濃度的乙醇逐級脫水，按常規石蠟法[28]包埋切片，厚度5～ 6 μm；采用HE 染色、中性樹膠封片。用光學顯微鏡觀察組織病理切片并拍照。

2 結果與分析

2.1 草魚NCCRP-1 和IL-10重組蛋白的表達與純化

草魚NCCRP-1的ORF 為714 bp (GenBank 登錄號HQ388293)，編碼237 個氨基酸，預測其分子質量7.3 ku，等電點為5.63。草魚IL-10的ORF 為540 bp (GenBank 登錄號HQ388294)，編碼179 個氨基酸，預測其分子質量為21.0 ku，等電點為8.34。

草魚NCCRP-1和IL-10的ORF 與表達質粒pET-32a 連接后，重組表達質粒pET-NCCRP 和pET-IL10 經菌落PCR 鑒定、雙酶切鑒定（圖1）和測序驗證，重組表達質粒構建正確。

圖1 重組表達質粒 pET-NCCRP 和pET-IL10 雙酶切Fig.1 Enzyme restriction of the recombinant expression plasmid pET-NCCRP and pET-IL10

重組表達質粒pET-NCCRP 和pET-IL10 轉化至大腸桿菌BL21 的最優表達條件分別為0.1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導4 h、1.0 mmol/L IPTG 37 ℃誘導6 h。重組表達質粒pET-NCCRP 表達的融合蛋白分子質量為47.8 ku（含融合標簽分子質量20.5 ku）（圖2）；含空質粒pET-32a 的BL21 菌體誘導后表達出20.5 ku 的融合標簽；未經誘導的含空質粒pET-32a和重組表達質粒pET-NCCRP 的BL21 菌體均未表達出目的蛋白（圖2）。重組表達質粒pET-IL10 表達的融合蛋白分子質量為41.5 ku（含融合標簽分子質量20.5 ku）（圖2）；含空質粒pET-32a 的BL21菌體誘導后表達出20.5 ku 的融合標簽；未經誘導的含空質粒pET-32a 和重組表達質粒pET-IL10 的BL21 菌體均無表達出目的蛋白（圖2）。表達的融合蛋白經純化、不同濃度的咪唑緩沖液洗脫和電泳檢測（圖3），發現200 mmol/L 咪唑的純化效果最佳，純化后重組蛋白NCCRP-1 和IL-10 質量濃度分別為690、520 μg/mL。

圖2 pET-NCCRP 和pET-IL10 在大腸桿菌中的表達Fig.2 Expression of pET-NCCRP and pET-IL10 in E.coli BL21

圖3 pET-NCCRP 和pET-IL10 重組蛋白的純化Fig.3 Purification of recombinant proteins pET-NCCRP and pET-IL10

2.2 兔抗草魚NCCRP-1 和IL-10 多克隆抗體效價

ELISA 檢測表明，NCCRP-1 和IL-10 均產生1∶40 000 的高效價特異抗體。western-blot 結果表明，NCCRP-1 抗血清可與重組蛋白發生抗原抗體反應，在48 ku 處有印跡條帶（目的蛋白）（圖4）；IL-10抗血清也可與重組蛋白發生特異性結合，在41 ku處有印跡條帶（目的蛋白）（圖4）。

圖4 融合蛋白NCCRP-1 和IL-10 的免疫印跡Fig.4 Western blot of the fusion proteins NCCRP-1 and IL-10

2.3 NCCRP-1 和IL-10 在腎臟和腸中的表達

免疫和感染后，NCCRP-1 和IL-10 在mRNA和蛋白水平檢測結果見圖5、6。圖5 表明，在腎臟和腸中，實驗組1 NCCRP-1 表達量最大，且實驗組1 與其他組差異顯著（P＜ 0.05）；實驗組1 與對照組1、對照組2 的表達也有顯著差異；NCCRP-1 在腎臟中表達量比腸中高。Western blot 結果（圖5）也可證明NCCRP-1 表達的差異。IL-10 定量PCR、Western blot 結果（圖6）表明，在腎臟和腸中，實驗組2 的表達高于其他組，但無顯著差異（P＞ 0.05）。

圖5 NCCRP-1 在腎臟和腸中的表達Fig.5 Expression of NCCRP-1 in kidney and intestine

圖6 IL-10 在腎臟和腸中的表達Fig.6 Expression of IL-10 in kidney and intestine

2.4 組織病理學觀察

圖7 為部分病理切片結果。對照組1（未免疫未攻毒）草魚腎臟和腸無病理變化；實驗組1（重組NCCRP-1 免疫和GCRV GD108 攻毒）草魚腎小管上皮基部輕微水腫，腎臟和腸輕微出血；實驗組2（重組IL-10 免疫和GCRV GD108 攻毒）草魚腎小管上皮水腫，有淋巴細胞散在壞死，腎臟和腸固有層出血；對照組2（未免疫和GCRV GD108 攻毒）草魚腎臟出血，腎小管上皮基部水腫，腎小管上皮有紅色團塊，腸固有層嚴重出血和散在細胞壞死。可見，NCCRP-1 免疫組、IL-10 免疫組、未免疫組的組織出血程度由輕變重、壞死從無到有、水腫程度由輕到重，即組織病理變化逐漸嚴重，因此，重組NCCRP-1 和重組IL-10 免疫對草魚抗GCRV GD108 感染有一定效果；而重組IL-10 免疫后草魚出血和水腫程度介于NCCRP-1 免疫組和未免疫組之間，因此免疫效果不顯著。

圖7 草魚腎臟和腸的組織病理切片Fig.7 Pathological sections of kidney and intestine of grass carp

續圖7（Continued）

3 討論

細胞免疫是魚類防御病毒感染的重要防線。NCCRP-1 和IL-10 在不同細胞免疫應答中發揮關鍵作用。本研究成功對草魚NCCRP-1和IL-10基因進行原核表達，純化獲得目的蛋白，制備高效價的免疫血清，并通過組織病理切片和表達變化分析NCCRP-1 和IL-10 在抗病毒感染中的作用。

草魚感染GCRV 后，NCCRP-1在各組織中表達量均上調，在腎臟中上調最大，在腸中次之[3]。GCRV GD108 基因型屬于GCRV Ⅱ型，主要臨床癥狀是腸道出血，呈現“腸炎型”癥狀[3,8]。其感染草魚7 d 后，NCCRP-1在草魚腎臟中表達上調至峰值[3]。因此，本研究分析免疫草魚在感染GCRV GD108 7 d 時的腎臟、腸組織病理切片，以及NCCRP-1 和IL-10 表達。

組織病理學分析表明，用重組NCCRP-1 和重組IL-10 免疫對草魚抗GCRV GD108 感染有一定效果，重組NCCRP-1 免疫后病理變化較輕，Yan 等[3]的研究亦表明NCCRP-1 參與了抗GCRV 感染的免疫反應；IL-10 在炎癥和自身免疫疾病中發揮重要作用[10]，但重組IL-10 免疫后病理變化較重，可能與GCRV 的致病機制等有關。

本研究表明，GCRV GD108 感染后，NCCRP-1表達在mRNA 和蛋白水平均上調（圖5），與其他研究[3,29]一致。Chaves-Pozo 等[29]研究表明，海鯛（Sparus aurata）和海鱸（Dicentrarchus labrax）感染野田村病毒（Viral nervous necrosis，VNN）后NCCRP-1的表達上調。NCCRP-1的表達上調與NCC 的殺傷機制相關[30]。NCCRP-1的表達可激活NCC，進而刺激細胞因子的釋放，裂解病毒感染的細胞[29-30]。本研究中，用重組NCCRP-1 免疫以及GCRV GD108 攻毒后，草魚NCCRP-1的表達量最大，推測外源NCCRP-1 可能誘導內源性NCCRP-1的產生，NCCRP-1 也可能是良好的免疫增強劑，因而促進了草魚NCCRP-1的表達，從而增強草魚抵御病毒感染的免疫應答。總之，從定量PCR、western blot 和組織病理學綜合分析可見，NCCRP-1 在草魚抗GCRV 感染過程中發揮著作用。關于魚類NCC和NCCRP-1 抵御病毒感染作用機制還有待深入研究。此外，細胞因子在抗感染方面有重要作用。外源重組細胞因子可在機體內發揮免疫佐劑作用，已在許多病毒疫苗中發揮出良好的免疫增強作用，還可提高疫苗的保護率，提高機體對疫苗的免疫應答，提高病毒蛋白的免疫原性等[31-32]。本研究中，重組NCCRP-1 也可能是作為外源重組細胞因子在GCRV 感染中發揮了作用。

IL-10 表達相對于NCCRP-1 上調不顯著，而且重組IL-10 免疫組（實驗組2）有較重的病理變化，說明其在GCRV 感染中抗病毒效果不明顯。雖然IL-10 有調節免疫平衡、釋放免疫介質、抗原呈遞等作用[10]，且已發現IL-10 在病毒感染中發揮作用，如HPV (human papilloma virus) 感染后，在HPV E2、E6 和E7 的作用下IL-10的表達上調[19]，KSHV（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus）編碼的miR-K12-3 可減少IL-10 的表達來促進腫瘤的發展[20]，在大西洋鮭（Salmo salarL.）感染SAV(Salmonid alphavirus) 過程中IL-10表達上調[15]，鱖（Siniperca chuatsi）感染ISKNV（infectious spleen and kidney necrosis virus）后IL-10表達顯著上調[16]；但本研究中，免疫和攻毒后，草魚IL-10表達變化不顯著，或與草魚IL-10 的作用和炎性反應相關。草魚IL-10 在GCRV 感染中的作用及GCRV 的感染機制有待進一步研究。

綜上，本研究對原核表達的草魚NCCRP-1 和IL-10 蛋白進行純化，制備兩者的高效價兔抗血清；重組NCCRP-1 和IL-10 免疫以及GCRV GD108 感染草魚后，草魚腎臟和腸組織病理切片分析，以及NCCRP-1、IL-10 的表達分析表明，外源NCCRP-1可能誘導內源性NCCRP-1 的產生，也可能是作為良好的免疫增強劑而增強草魚抵御病毒感染的免疫應答，因此，NCCRP-1 在草魚抗GCRV 感染過程中發揮作用；而IL-10 對GCRV 的抗感染作用不顯著，具體機制有待進一步研究。本研究可為開發草魚出血病新型基因工程疫苗、新型免疫佐劑等提供依據。