紅鰭東方鲀B-FABP 基因SNPs 篩選及其與生長性狀關聯(lián)分析

楊 曉，馬文超，楊 金，茍盼盼，包玉龍，王秀利，劉圣聰，仇雪梅

（1.大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，遼寧 大連 116023；2.大連天正實業(yè)有限公司，遼寧 大連 1 160116）

腦型脂肪酸結合蛋白（Brain-like fatty acid binding proteins，B-FABP）最初是在腦組織中發(fā)現(xiàn)，主要功能是結合以及運輸多不飽和脂肪酸PUFAs，這些脂肪酸在生長早期的細胞分化、突觸活化以及光感受器膜的生物合成中必不可少[1-3]。在對北京油雞進行全基因組分析中發(fā)現(xiàn)，B-FABP基因與北京油雞的體質(zhì)量、屠體性狀有顯著相關性[4]，由此分析B-FABP基因可以作為影響生長性狀的候選基因。對斑馬魚（Danio rerio）進行原位雜交研究發(fā)現(xiàn)，B-FABP在斑馬魚早期發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達[5]。但目前尚未見B-FABP基因?qū)︳~類生長調(diào)控作用的研究報道。

全基因組重測序技術廣泛應用于遺傳變異檢測、性狀基因定位等方面研究[6]。Li 等[7]對48 份家豬樣本進行全基因組重測序，與55 個歐亞野豬和家豬基因組數(shù)據(jù)對比分析，發(fā)現(xiàn)了低氧適應、能量代謝等268 個基因位點，揭示了藏豬高原低氧適應的遺傳基礎；朱文[8]對“金鱗一號”皇姑魚（Nibea albiflora）的體質(zhì)量、體長、體高、體厚四個生長性狀進行了基因組關聯(lián)分析，篩選出了13 個與生長性狀有關的候選基因。

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）是一種肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富的重要經(jīng)濟魚類，在我國多分布于中部和北部海域，是我國重要的出口水產(chǎn)品之一。近年來海洋環(huán)境污染嚴重，致使紅鰭東方鲀自然種群資源不斷衰減，但其人工養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大，因此選育具有優(yōu)良生長性狀的紅鰭東方鲀?nèi)后w有實際經(jīng)濟意義。本研究以紅鰭東方鲀?yōu)椴牧希萌蚪M重測序技術篩選B-FABP基因上的SNPs 位點，并對突變位點進行基因型分型，利用SPSS 軟件分析B-FABP基因的SNPs 與紅鰭東方鲀生長性狀之間的關系，以期為探究B-FABP對紅鰭東方鲀生長性狀的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用魚均取自河北省唐山市牧海水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司的紅鰭東方鲀?nèi)后w，共308 尾。養(yǎng)殖周期為1 a，分別在6 月齡和12 月齡時進行生長性狀測量和樣品采集，其中6 月齡的體質(zhì)量范圍為69.5～458.6 g，12 月齡的體質(zhì)量范圍為162.8～ 630.3 g。

1.2 方法

1）取樣及生長性狀測定：體質(zhì)量用電子天平稱量，精確到0.1 g；形態(tài)性狀的測量方法參照王新安等[9]的方法，11 個形態(tài)性狀分別為體質(zhì)量、體長、體全長、尾柄長、體高、頭長、頭軀長、尾長、尾柄高、尾柄寬以及體寬，測量時利用手機支架固定手機進行拍照，盡量保證拍照時樣本位置基本一致，測量參數(shù)結果精確到0.001 cm。

2）基因組提取：采集魚鰭用于基因組提取。使用海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）對采取的樣品進行基因組制備，將提取的基因組DNA 放于-20 ℃保存。

3）基因組重測序：將提取得到的基因組送至北京生工生物工程股份有限公司進行文庫構建。

4）原始數(shù)據(jù)質(zhì)控和過濾：原始測序數(shù)據(jù)利用Fastp（v0.11.5）進行質(zhì)控，對數(shù)據(jù)進行過濾，得到質(zhì)量較好的數(shù)據(jù)。

5）SNPs 位點的檢測和標記：用紅鰭東方鲀參考序列與獲得的測序序列進行比對，并進行變異位點的篩選。

6）紅鰭東方鲀生長性狀及其與SNP 的生物統(tǒng)計分析：采用SPSS 22.0 軟件進行相關性分析，建立生物統(tǒng)計模型式為：Yij=μ+Gi+eij，其中Yij表示某個性狀第i基因型的第j個個體的生長觀測值；μ是實驗觀測值所有樣本的均值；Gi是基因型i的有效生物學價值；eij表示隨機誤差對觀測值的影響。將B-FABP基因上的SNP 位點不同基因型與紅鰭東方鲀的體質(zhì)量（BWH）、體長（BL）、體全長（TL）、尾柄長（CPL）、體高（BD）、頭長（HL）、頭軀長（HL+TR）、尾長（TA）、尾柄高（CPD）、尾柄寬（CPB）、體寬（BW）共11 個形態(tài)性狀進行關聯(lián)分析，計算結果用平均值±標準差（mean±SD）表示，P＜0.05 表示顯著相關，P＜0.01 表示極顯著相關。

2 結果與分析

2.1 6 月齡和12 月齡紅鰭東方鲀生長性狀關聯(lián)分析

本研究驗共篩選到3 個SNP 位點，其基因型和紅鰭東方鲀個體數(shù)統(tǒng)計見表1。6 月齡和12 月齡紅鰭東方鲀?nèi)后w中各SNPs 位點與生長性狀相關性結果見表2、3。

表1 紅鰭東方鲀B-FABP 基因SNPs 位點基因型分型Table 1 Genotyping map of the SNPs locus of the B-FABP gene of Takifugu rubripes

從表2 可以看出，6 月齡紅鰭東方鲀個體中，C442T 位點的多態(tài)性與生長性狀均無顯著相關（P＞0.05），CC 基因型個體顯著高于TT 基因型個體（P＜0.05），其他性狀均沒有達到顯著水平；G676A和C731A 位點的多態(tài)性與大多數(shù)生長性狀都存在顯著關聯(lián)性（P＜0.05）。其中，G676A 位點的GA基因型個體的體質(zhì)量、體高、尾柄寬均顯著高于AA 基因型個體（P＜0.05），GG 基因型的頭長顯著高于GA 基因型（P＜0.05）；C731A 位點的AA基因型個體的體質(zhì)量、體長、體全長、尾柄長、體高、頭長、尾長、尾柄高均顯著高于CC 基因型（P＜0.05），并且在體長、體全長、尾柄長、頭長、尾長和尾柄高上達到極顯著水平（P＜0.01），AA基因型的個體在體長、體全長、尾柄長、尾長均顯著高于AC 基因型個體（P＜0.05），CC 基因型個體的尾柄長、頭長、尾長均顯著高于AC 基因型（P＜0.05），其中在頭長性狀上達到極顯著水平（P＜0.01）。

表2 B-FABP 基因SNP 位點基因型與6 月齡紅鰭東方鲀生長性狀的關聯(lián)分析Table 2 Correlation analysis between the SNP genotype of B-FABP gene and the growth traits of 6-month-old Takifugu rubripes

表3 可以看出，在12 月齡紅鰭東方鲀個體中，各突變位點與6 月齡個體一致。其中C442T 位點與生長性狀沒有顯著相關（P＞ 0.05）；G676A 位點與大多數(shù)生長性狀都存在顯著關聯(lián)，GA 基因型個體的體全長、體高、頭長、頭軀長、尾柄寬、體寬均顯著高于GG 基因型個體（P＜0.05），并且在體全長、體高、頭長、頭軀長、體寬上達到極顯著水平（P＜0.01），GG 基因型個體體長與尾長極顯著高于GA 基因型個體（P＜0.01），GA 基因型個體的體寬性狀顯著高于AA 基因型個體（P＜0.05）；C731A 位點只與體寬性狀有顯著相關，AA 基因型個體的體寬顯著高于CC 基因型個體（P＜0.05），CC 基因型個體的體寬顯著高于AC 基因型個體（P＜0.05），其他性狀均沒有達到顯著水平（P＞ 0.05）。

表3 B-FABP 基因SNP 位點基因型與12 月齡紅鰭東方鲀生長性狀的關聯(lián)分析Table 3 Correlation analysis between the SNP genotype of B-FABP gene and the growth traits of 12-month-old Takifugu rubripes

2.2 6 月齡和12 月齡紅鰭東方鲀表型性狀關聯(lián)分析

為了解不同生長階段紅鰭東方鲀各主要性狀之間的關系及影響，對不同月齡的紅鰭東方鲀表型形狀進行了相關性分析，結果見表4、5。6 月齡紅鰭東方鲀各表型之間為正相關，其中體質(zhì)量和體長、體高相關性均較大，與體全長較次之；12 月齡紅鰭東方鲀各表型之間為正相關，其中體質(zhì)量、體長和體全長均與體高相關性較大。

表4 6 月齡紅鰭東方鲀的表型相關分析Table 4 Correlation analysis of phenotype of redfin pufferfish at 6 months old

2.3 不同SNPs 位點的遺傳連鎖分析

通過對檢測到的3 個SNPs 位點進行遺傳連鎖分析。圖中白色和灰度圖中的數(shù)字表示相關系數(shù)R2×100 的值，該值≥80 時表示兩個位點之間有連鎖反應，由此可以得出這三個位點之間沒有連鎖關系，為獨立遺傳（圖1）。

圖1 SNPs 位點遺傳連鎖圖Fig.1 SNPs genetic linkage map

表5 12 月齡紅鰭東方鲀的表型相關分析Table 5 Correlation analysis of phenotype of redfin pufferfish at 12 months old

3 討論

使用脂肪酸結合蛋白基因作為腹脂率、腹脂重以及生長性狀的分子標記候選基因，在豬[10]、雞和牛[11-12]等有報道，如仇雪梅、王啟貴等[13-15]對雞細胞外脂肪酸結合蛋白（Ex-FABP）的單核苷酸位點的研究發(fā)現(xiàn)，Ex-FABP的SNP 位點對雞的屠體性狀有顯著關聯(lián)，并且腸型脂肪酸結合蛋白（I-FABP）基因上的SNPs 位點變化對肉雞體質(zhì)量性狀有顯著影響[16]；對北京鴨體尺以及胴體性狀與FABP2基因的SNPs 研究發(fā)現(xiàn)，該基因可以作為北京鴨體尺和屠體性狀標記輔助選擇的分子標記[17]；吳丹[4]在對北京油雞體質(zhì)量和屠體性狀進行全基因組關聯(lián)分析時發(fā)現(xiàn)，B-FABP基因與其體質(zhì)量、屠體性狀有顯著相關性；在魚類中，夏正龍[18]通過對建鯉（Cyprinus carpiovar.Jian）脂肪酸結合蛋白基因進行SNPs 的篩選，發(fā)現(xiàn)其突變位點與建鯉的增重有顯著相關。

本研究首次對B-FABP基因的遺傳突變與紅鰭東方鲀生長性狀的之間進行關聯(lián)分析。結果顯示，紅鰭東方鲀B-FABP基因上發(fā)現(xiàn)3 個SNPs 位點，分別為C442T、G676A、A731C。其中，第二外顯子上一個（C442T），第三內(nèi)含子上兩個（G676A、A731C），并且通過遺傳連鎖分析發(fā)現(xiàn)，三個SNPs位點沒有連鎖現(xiàn)象。第二外顯子上的突變導致氨基酸的改變，原來的蘇氨酸（Thr）被替換為甲硫氨酸（Met）。筆者對此位點中的三種基因型和紅鰭東方鲀的生長性狀進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)6 月齡的體質(zhì)量等相關性狀明顯CC 基因型的高于TT 基因型，但由于該多態(tài)性位點TT 基因型群體數(shù)量較少，并且不同個體之間標準差較小，導致數(shù)據(jù)離散程度較低，故使用SPSS 22 分析時其體質(zhì)量性狀雖平均值相差較大，但并沒有顯著差異，因此后續(xù)會加大檢測的群體數(shù)量，對結果進行充分驗證；第三內(nèi)含子上的突變與6、12 月齡的紅鰭東方鲀個體的大多數(shù)生長性狀均有顯著關聯(lián)，其中G676A 位點中的GA基因型個體體全長、體高、頭長、頭軀長、尾柄寬、體寬等生長性狀顯著高于GG 基因型個體（P＜0.05）。

本研究發(fā)現(xiàn)SNPs 突變位點位于內(nèi)含子區(qū)域。雖然內(nèi)含子不具有編碼氨基酸的能力，但是已有較多研究結果證明發(fā)生在內(nèi)含子內(nèi)的突變也可對生物生長性狀產(chǎn)生影響，如對藏羊[19]（Ovis aries）MC4R基因的研究中發(fā)現(xiàn)，與其生長性狀密切相關的SNP 位點位于第一內(nèi)含子上；張世勇等[20]對斑點叉尾鮰（Ictalures punctatus）MSTN基因與生長性狀的關系研究發(fā)現(xiàn)，與其體質(zhì)量、體長顯著相關SNP 標記位于第二內(nèi)含子上；謝淑媚等[21]在縊蟶（Sinonovacula constricta）IGFBP基因第1 個內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)1 個與體質(zhì)量、殼長顯著相關的SNP 位點；王啟貴等[22]在雞L-FABP基因的5′側翼區(qū)檢測到2個SNPs 位點（G204A 和T205C），這兩個多態(tài)性位點與雞的腹脂質(zhì)量和腹脂率有顯著相關性；同時，徐松松等[16]研究發(fā)現(xiàn)，雞的F2 資源群體中在I-FABP基因的內(nèi)含子1 和內(nèi)含子2 中發(fā)現(xiàn)2 個SNPs，與雞的生長性狀也顯著相關。雖然內(nèi)含子上的突變不會影響編碼蛋白質(zhì)的合成，但是與基因轉錄調(diào)控有關[23-25]，所以內(nèi)含子中SNPs 位點可能與基因組區(qū)域中相關聯(lián)的關鍵基因突變位點有連鎖反應[26-27]。因此，在內(nèi)含子上的突變有可能對B-FABP基因的翻譯、結構和功能產(chǎn)生影響[28]。這些結果與本研究結果相吻合，證明B-FABP基因上的SNPs 對紅鰭東方鲀的生長性狀有一定影響，因此其可作為紅鰭東方鲀分子育種的候選分子標記，也可以作為生長性狀的候選基因。