基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究加味柴芍六君湯治療慢性萎縮性胃炎的作用機(jī)制

林澤豪，傅 頤，陳靜怡，莊芬妮，黃安聞，連雄瀚，朱景茹，涂文玲，甘慧娟

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122）

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是臨床常見(jiàn)的消化性疾病，為胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵始動(dòng)環(huán)節(jié)，以胃黏膜固有腺體萎縮為主要病理特點(diǎn)，甚至伴見(jiàn)腸化或上皮內(nèi)瘤變，被世界衛(wèi)生組織定義為癌前狀態(tài)。該病癥狀易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其發(fā)病率和檢出率隨年齡增長(zhǎng)而增加［1-2］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療CAG主要采取根除幽門螺桿菌（Hp）、胃黏膜保護(hù)、抗氧化治療、促進(jìn)胃黏膜再生、內(nèi)鏡微創(chuàng)技術(shù)等治療方法［3］，臨床取得一定療效，但多以對(duì)癥治療為主，遠(yuǎn)期療效較差。因此，迫切需要一種替代療法用以防治CAG。中醫(yī)藥治療消化疾病具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊前景，且因其療效安全，不良反應(yīng)小的特點(diǎn)而備受關(guān)注，臨床上有諸多醫(yī)家運(yùn)用加味柴芍六君湯治療CAG取得了良好的療效［4-6］，然而其治療CAG的作用機(jī)制尚未得到充分揭示。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程、從改善或恢復(fù)生物網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀角度認(rèn)識(shí)藥物與機(jī)體的相互作用并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)［7］，近年來(lái)，越來(lái)越多科研工作者從系統(tǒng)的角度探討中藥復(fù)方多成分多靶點(diǎn)與疾病的關(guān)系，為現(xiàn)代中醫(yī)藥的研究提供了新的方向。因此，本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為切入點(diǎn)，對(duì)加味柴芍六君湯治療CAG的靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其治療CAG的可能作用機(jī)制。

1 方 法

1.1 加味柴芍六君湯有效活性成分與作用靶點(diǎn)搜集與篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（簡(jiǎn)稱TCMSP，http：／／tcmspw.com／tcmsp.php），分別以“白 芍”“白術(shù)”“半夏”“柴胡”“陳皮”“丹參”“莪術(shù)”“茯苓”“甘草”“人參”為檢索詞進(jìn)行檢索，設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，搜集加味柴芍六君湯的有效活性成分信息。然后對(duì)篩選出的有效活性成分進(jìn)行蛋白靶標(biāo)查找，將獲取的蛋白靶標(biāo)進(jìn)行基因名稱轉(zhuǎn)換，獲取加味柴芍六君湯的作用靶點(diǎn)信息。

1.2 CAG的疾病作用靶點(diǎn)獲取 用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)“Chronic at-rophic gastritis”進(jìn)行檢索，獲取CAG的疾病作用靶點(diǎn)。通過(guò)Venny 2.1.0在線工具，獲得CAG與加味柴芍六君湯共同作用靶點(diǎn)，即加味柴芍六君湯治療CAG的作用靶點(diǎn)。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的可視化構(gòu)建與分析 將加味柴芍六君湯的有效活性成分-作用靶點(diǎn)信息、單味藥-有效活性成分信息和CAG-作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入C-ytoscape3.7.2軟件，分別繪制出三者之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，再利用“Merge”功能將其合并成加味柴芍六君湯治療CAG的有效活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。將共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入到String數(shù)據(jù)庫(kù)“Multiple proteins”檢索框中，以互動(dòng)得分≥0.900為篩選條件，構(gòu)建加味柴芍六君湯與CAG之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)），并對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.4 GO生物學(xué)過(guò)程和KEGG信號(hào)通路富集分析利用String數(shù)據(jù)庫(kù)分析后的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程和KEGG信號(hào)通路富集分析；利用Bioconductor生物信息軟件包，對(duì)所預(yù)測(cè)的化學(xué)成分靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，以P＜0.05為篩選條件進(jìn)行可視化處理，再將加味柴芍六君湯對(duì)應(yīng)的靶蛋白直接映射到通路上，選取既包含藥物靶點(diǎn)又包含疾病靶點(diǎn)的通路做出KEGG信號(hào)通路富集分析柱狀圖。

1.5 分子對(duì)接 利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)得到加味柴芍六君湯活性成分的結(jié)構(gòu)信息，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到核心靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)信息，最后利用Vina1.1.2軟件完成加味柴芍六君湯活性成分與靶點(diǎn)受體的分子對(duì)接。

2 結(jié) 果

2.1 加味柴芍六君湯靶點(diǎn)信息獲取 共篩選出加味柴芍六君湯有效活性成分195個(gè)（其中白芍13個(gè)、白術(shù)7個(gè)、半夏13個(gè)、柴胡17個(gè)、陳皮5個(gè)、丹參65個(gè)、莪術(shù)3個(gè)、茯苓15個(gè)、甘草92個(gè)、人參22個(gè)），藥物靶點(diǎn)265個(gè)。文中只保留OB值排名第1的有效活性成分，見(jiàn)表1。將經(jīng)過(guò)篩選轉(zhuǎn)化的單味中藥主要活性成分及作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建加味柴芍六君湯治療CAG的有效活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。

表1 加味柴芍六君湯有效活性成分

圖1 加味柴芍六君湯治療CAG的有效活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.2 加味柴芍六君子湯治療CAG的作用靶點(diǎn)獲取 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到CAG作用靶點(diǎn)613個(gè)，將加味柴芍六君子湯的作用靶點(diǎn)和CAG的作用靶點(diǎn)分別輸入Venny 2.1.0在線工具分析，得到共同靶點(diǎn)89個(gè)。見(jiàn)圖2。

圖2 疾病-藥物-靶點(diǎn)（DDT）韋恩圖

2.3 相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將89個(gè)共同作用靶點(diǎn)輸入到String數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建出這89個(gè)共同作用靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)模型。見(jiàn)圖3。該網(wǎng)絡(luò)包含89個(gè)共同作用靶點(diǎn)，336條連接線，平均度值為35.8，其中NFKBIA、SPP1、CASP9、TIMP1、MMP1、MCL1、CDKN1A、HIF1A、SERPINE1、STAT1、MPO、VCAM1、PPARG、AR、CASP8、IFNG、ERBB2、ICAM1、BCL2L1、MMP2、CAT、MAPK14、FOS、CCL2、IL1B、CCND1、EGFR、MYC、MAPK1、CXCLB、MMP9、EGF、STAT3、MAPK3、CASP3、VEGFA、MAPK8、PTGS2、JUN、TP53、AKT1的度值高于平均度值即為相對(duì)核心靶點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

圖3 共同作用靶點(diǎn)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO生物學(xué)過(guò)程富集分析 通過(guò)R軟件運(yùn)行腳本對(duì)89個(gè)共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程富集分析，獲得P＜0.05的GO條目117個(gè)，結(jié)果表明加味柴芍六君湯治療CAG過(guò)程主要涉及磷酸酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、蛋白磷酸酶結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程，文中共列出排名前20的GO富集氣泡圖。見(jiàn)圖4。

圖4 前20名GO富集氣泡圖

2.5 KEGG信號(hào)通路富集分析 通過(guò)R軟件運(yùn)行腳本對(duì)89個(gè)共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，根據(jù)P＜0.05篩選到152條信號(hào)通路，涉及到的信號(hào)通路類型主要有病毒感染（卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染等）、癌癥（前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等）、信號(hào)傳導(dǎo)（PI3K-Akt信號(hào)、AGE-RAGE信號(hào)、MAPK信號(hào)、HIF-1信號(hào)、JAK-STAT信號(hào)、RIG-I樣受體信號(hào)、B細(xì)胞受體信號(hào)、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)等）、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、麻疹等。見(jiàn)圖5。

圖5 KEGG信號(hào)通路富集分析柱狀圖

2.6分子對(duì)接 為了進(jìn)一步驗(yàn)證“有效活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)結(jié)果，將前5位核心靶點(diǎn)AKT1、TP53、JUN、PTGS2、MAPK8與其對(duì)應(yīng)的主要活性成分kaempferol、baicalein、beta-sitosterol、Cavidine、nobiletin進(jìn)行分子對(duì)接，獲得的相關(guān)對(duì)接參數(shù)以及相應(yīng)的計(jì)算結(jié)果，見(jiàn)表2。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的自由能越低，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生作用的可能性越大，加味柴芍六君湯的主要活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合自由能均＜-5 kcal／mol，提示篩選出的核心靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的活性成分具有良好的親和力，證明結(jié)果具有一定的可信度。前5位核心靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的活性成分對(duì)接結(jié)果，見(jiàn)圖6。

表2 活性成分與核心靶點(diǎn)對(duì)接參數(shù)及計(jì)算結(jié)果

圖6 對(duì)接結(jié)果圖

3 討 論

近年來(lái)，CAG的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，且逐漸趨于年輕化，發(fā)病機(jī)制尚未明確，由于內(nèi)外多重因素刺激導(dǎo)致胃黏膜腺體遭受破壞，從而出現(xiàn)萎縮、腸上皮化生甚至異型增生等難以逆轉(zhuǎn)的病理學(xué)改變，長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作容易誘發(fā)癌變，是許多科研工作者廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一［8］。課題組前期研究證實(shí)，肝郁脾虛是CAG重要病理特點(diǎn)，肝郁、脾虛常相互影響，氣郁、脾虛導(dǎo)致水液代謝障礙，產(chǎn)生痰濕，痰濕反過(guò)來(lái)影響了肝、脾功能，加重病情［9］。加味柴芍六君湯方中柴胡疏肝行氣；白芍養(yǎng)血柔肝；人參、茯苓、白術(shù)健脾益氣；半夏、陳皮理氣燥濕化痰，和胃降逆；丹參活血祛瘀，通經(jīng)止痛；莪術(shù)辛溫，破血止痛；甘草調(diào)和諸藥。全方共奏健脾和胃、活血祛瘀、疏肝理氣之功。現(xiàn)代藥理研究表明，白術(shù)能雙向調(diào)節(jié)胃腸道，保護(hù)胃黏膜，提高免疫功能；白芍具有調(diào)節(jié)免疫，解除平滑肌痙攣?zhàn)饔茫渲猩炙庍澳芸寡住⒈Ｗo(hù)胃黏膜；甘草具有抗?jié)儭⒖汞d攣、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤及解毒功效［10］。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討加味柴芍六君湯治療CAG的可能作用機(jī)制。通過(guò)對(duì)加味柴芍六君湯有效活性成分、作用靶點(diǎn)搜集與篩選，獲取195個(gè)有效活性成分，包含槲皮素、常春藤皂苷元、甘草甜素、蓽澄茄素、米橘素等。槲皮素能逆轉(zhuǎn)DKK3啟動(dòng)子甲基化恢復(fù)其表達(dá)將有助于抑制胃癌的惡性轉(zhuǎn)化。槲皮素逆轉(zhuǎn)MSX1基因的甲基化狀態(tài)后，恢復(fù)MSX1基因的功能則可誘導(dǎo)DKK3等基因的表達(dá)，理論上也可間接抑制胃癌的發(fā)生［11］。常春藤皂苷元能抑制胃癌MGC803增殖，對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、黏附、遷移能力有著明顯的影響，是一種良好的抗腫瘤藥物［12］。在對(duì)炎癥趨化因子和促炎癥因子的表達(dá)方面，甘草甜素能夠抑制結(jié)腸髓過(guò)氧化物酶，減少活性氧化物質(zhì)導(dǎo)致的脂質(zhì)蛋白變性和器官損傷，改善炎癥癥狀［13］。

將加味柴芍六君湯的作用靶點(diǎn)和CAG的作用靶點(diǎn)分別輸入Venny2.1.0在線工具分析，得到共同作用靶點(diǎn)89個(gè)。通過(guò)構(gòu)建共同作用靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，分析得出IL1B、AKT1、TP53、JUN、MAPK8、VEGFA、MAPK3、STAT3、MAPK1等41個(gè)相對(duì)核心靶點(diǎn)。其中IL-1β是典型的促炎性細(xì)胞因子，炎性信號(hào)可通過(guò)激活炎癥小體而刺激分泌IL-1β，過(guò)量分泌的IL-1β會(huì)引起廣泛的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎性損傷［14］。IL-1β還是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的胃酸分泌抑制劑，持續(xù)的低酸分泌會(huì)促進(jìn)萎縮的發(fā)生發(fā)展，增加胃癌的發(fā)生危險(xiǎn)［15-16］。IL-6是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，是發(fā)動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性因子，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮發(fā)生細(xì)胞活化，刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，并產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)［17］。有研究表明，IL-6在胃黏膜炎癥反應(yīng)過(guò)程中具有極其明顯的指示作用，但是達(dá)到了一定的范圍就可能會(huì)對(duì)胃黏膜產(chǎn)生損傷作用［18］。

通過(guò)GO生物學(xué)過(guò)程富集分析可知，加味柴芍六君湯對(duì)CAG的治療作用主要通過(guò)參與以下生物學(xué)過(guò)程而發(fā)揮療效：磷酸酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、蛋白磷酸酶結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程。進(jìn)一步的KEGG信號(hào)通路富集分析提示，加味柴芍六君湯主要通過(guò)調(diào)控HIF-1、PI3K-Akt、MAPK等多種信號(hào)通路而達(dá)到治療CAG的作用。HIF-1α與慢性炎性反應(yīng)的關(guān)系密切，是廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，該基因由低氧誘導(dǎo)并介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境進(jìn)行適性反應(yīng)，缺氧時(shí)HIF-1α表達(dá)顯著上調(diào)，由此啟動(dòng)60余種下游因子的轉(zhuǎn)錄以使細(xì)胞逐漸適應(yīng)有氧到缺氧的轉(zhuǎn)變［19］。PI3K／Akt途徑信號(hào)傳導(dǎo)與異常細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)，這兩者都與腫瘤發(fā)生直接相關(guān)，PI3K／Akt通路在胃癌細(xì)胞增殖和存活中發(fā)揮著重要作用［20］。MAP-K途徑可以將細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，對(duì)多數(shù)細(xì)胞的增生和程序化死亡等的調(diào)節(jié)起到重要意義［21］。分子對(duì)接結(jié)果顯示，加味柴芍六君湯活性成分與相應(yīng)核心靶點(diǎn)對(duì)接親和力良好，對(duì)接體系穩(wěn)定，進(jìn)一步證明了本研究關(guān)于加味柴芍六君湯治療CAG機(jī)制的有效性與可靠性。

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從整體和系統(tǒng)的角度初步預(yù)測(cè)了加味柴芍六君湯治療CAG的作用機(jī)制，其可能是通過(guò)抗炎，降低炎性因子IL-1β、IL-6的水平來(lái)減輕CAG黏膜細(xì)胞的缺氧狀態(tài)，調(diào)節(jié)HIF-1α等細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和蛋白的表達(dá)，或通過(guò)調(diào)控HIF-1、PI3K-Akt、MAPK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而改善胃黏膜瘀血狀態(tài)，起到抗胃黏膜萎縮的作用，具有一定的研究?jī)r(jià)值。為進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的可靠性，后期有必要開(kāi)展相應(yīng)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡述加味柴芍六君湯治療CAG的作用機(jī)制。