豬骨骼肌肌鈣蛋白T單克隆抗體的制備及鑒定

張靜 李玉靜 張二敬 李紫然 劉靜靜 李春生

摘 要：為制備豬骨骼肌肌鈣蛋白T單克隆抗體，利用生物化學(xué)方法提取豬骨骼肌肌鈣蛋白并免疫小鼠，通過細(xì)胞融合制備穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，采取體內(nèi)誘生腹水法批量制備單克隆抗體，并對其免疫學(xué)特征進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：最終篩選獲得1 株雜交瘤細(xì)胞株，將其命名為2E8，其分泌的抗體為免疫球蛋白G 2a亞型，效價為1∶4.1×105，親和力常數(shù)為5.14×106 L/mol;采用間接酶聯(lián)免疫吸附測定檢測單克隆抗體2E8特異性，結(jié)果表明，單克隆抗體2E8與雞、鴨檢測原的交叉反應(yīng)率均為25%;與牛、羊檢測原的交叉反應(yīng)率分別為1.7%、6.3%;免疫印跡檢測結(jié)果顯示，單克隆抗體2E8與豬檢測原反應(yīng)條帶清晰，與羊、雞、鴨檢測原反應(yīng)條帶輕微，與牛檢測原幾乎不發(fā)生反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：豬骨骼肌肌鈣蛋白T;單克隆抗體;肉類摻假;間接酶聯(lián)免疫吸附測定;免疫學(xué)特征

Preparation and Characterization of Monoclonal Antibody against Porcine Skeletal Muscle Troponin T

ZHANG Jing1， LI Yujing2， ZHANG Erjing3， LI Ziran3， LIU Jingjing1， LI Chunsheng1，*

（1. Institute of Biology， Hebei Academy of Science， Shijiazhuang 050081， China; 2. Hebei Jiaotong Vocational and Technical College， Shijiazhuang 050035， China; 3. College of Life Sciences， Hebei Normal University， Shijiazhuang 050024， China）

Abstract： In order to prepare monoclonal antibodies against porcine skeletal muscle troponin T （sTnT）， porcine skeletal muscle troponins were extracted by biochemical methods and used to immunize mice. By means of cell fusion， we acquired hybridoma cell strains that can secrete monoclonal antibodies （mAbs） stably. Ascites was induced in vivo to further prepare and characterize monoclonal antibodies against sTnT. Finally， we screened out one hybridoma cell strain that secretes mAb stably and named it 2E8. The monoclonal antibody 2E8 belonged to the IgG2a subtype， whose titer and affinity constant were 1 ： 4.1 × 105 and 5.14 × 106 L/mol， respectively. The specificity of 2E8 was evaluated by indirect enzyme-linked immunosorbent assay （iELISA）. The cross-reactivity with chicken sTnT and duck sTnT were both 25%. The cross-reactivity with bovine sTnT and goat sTnT were 1.7% and 6.3% respectively. Immunoblotting data showed that the monoclonal antibody 2E8 exhibited a clear band after reaction with the porcine antigen， but only a slight band after reaction with the goat， chicken， or duck antigen. In addition， the monoclonal antibody hardly reacted with the bovine antigen.

Keywords： porcine skeletal muscle troponin T; monoclonal antibody; meat adulteration; indirect enzyme-linked immunosorbent assay; immunological characteristics

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210417-102

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）09-0033-05

引文格式：

張靜， 李玉靜， 張二敬， 等. 豬骨骼肌肌鈣蛋白T單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 肉類研究， 2021， 35（9）： 33-37. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210417-102.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Jing， LI Yujing， ZHANG Erjing， et al. Preparation and characterization of monoclonal antibody against porcine skeletal muscle troponin T[J]. Meat Research， 2021， 35（9）： 33-37. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210417-102.

http：//www.rlyj.net.cn

肉類及其制品是百姓餐桌上不可或缺的美味，市場對肉類的需求逐年增加，肉類產(chǎn)品的質(zhì)量問題隨之成為重要的民生問題，在利益驅(qū)使下，肉類及其制品摻假問題頻繁發(fā)生。例如，豬肉、雞肉或鴨肉部分代替牛肉或羊肉[1-2]、馬肉充當(dāng)牛肉[3]、馬肉冒充驢肉[4]等。目前，對肉類及其制品摻假檢測技術(shù)主要有感官鑒別[5]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[6-12]、紅外光譜[13-17]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[18-22]、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[23-27]等方法。ELISA方法基于抗原與抗體的特異性結(jié)合，從而捕獲目的蛋白，具有高敏感性、特異性的特點(diǎn)，且方法簡便，不需要昂貴的儀器設(shè)備[28]。

肉制品加工過程中常采用的蒸煮、烘烤等處理會導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解或損失[28]。對耐熱性標(biāo)志蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，肌鈣蛋白具有熱穩(wěn)定性，可以作為生肉及熱加工肉制品的肉源性成分鑒別標(biāo)志蛋白[29-30]。骨骼肌肌鈣蛋白是調(diào)節(jié)橫紋肌收縮功能的結(jié)構(gòu)蛋白，包括sTn T、sTn C和sTn I 3 個亞基，其分子質(zhì)量分別為37、18、24 kDa[31-34]。

本研究采用2 種蛋白質(zhì)提取方法[28-29]，對豬骨骼肌肌肉組織進(jìn)行研磨、煮沸、勻質(zhì)等操作，獲得豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原及檢測原。通過免疫小鼠制備單克隆抗體，并對抗體的效價、特異性等特征進(jìn)行評價。本研究對建立豬肉源性成分免疫學(xué)鑒別方法，進(jìn)一步促進(jìn)肉類制品摻雜、摻假的快速檢測研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、細(xì)胞培養(yǎng)板 美國康寧公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國Gibco公司;HAT培養(yǎng)基補(bǔ)充劑（50×）Hybri-MaxTM、HT培養(yǎng)基補(bǔ)充劑（50×）Hybri-MaxTM、免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）亞型檢測試劑盒 美國Sigma公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 北京中杉金橋生物科技有限公司;丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris、四甲基乙二胺（N，N，N，N-tetramethylethylenediamine，TEMED） 美國BBI公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

BALB/c小鼠由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2018-004。

1.2 儀器與設(shè)備

MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司;SW-CJ-2FD凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;CKX41SF倒置顯微鏡 日本Olympus公司;4710超聲破碎儀

美國Cole-Parmer儀器公司;Heraus Multifuge高速冷凍離心機(jī)、ND2000超微量核酸蛋白測定儀、MT-13K-L迷你手持均質(zhì)儀 杭州米歐儀器有限公司、Multiskan Go 1510型酶標(biāo)儀 德國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原的提取及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）鑒定

取新鮮豬腿肉10 g，去除脂肪及結(jié)締組織，剁碎，加入20 mL 0.15 mol/L NaCl溶液，用勻質(zhì)儀勻質(zhì)1 h。超聲波（100 W、5 min）處理后沸水浴20 min，6 000 r/min離心30 min，取上清液，121 ℃、0.12 MPa處理30 min。用Whatman No.1濾紙過濾，向?yàn)V液中按體積比1∶3.74加入體積分?jǐn)?shù)90%乙醇，8 000 r/min離心20 min，棄上清，將沉淀溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中，得到豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原，用超微量核酸蛋白測定儀測定溶液蛋白質(zhì)量濃度，于-20 ℃或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

配制12%分離膠、5%濃縮膠，對豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.2 檢測原的提取及SDS-PAGE鑒定

取新鮮豬、牛、羊、雞、鴨腿肉若干，切塊、分裝，于-80 ℃保存，使用前于室溫放置3 h完全解凍。分別稱取各種肉樣10 g，剁碎，分別裝于離心管中，沸水浴15 min后，立即用冰水冷卻，向離心管中加入20 mL含0.5 mol/L NaCl的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，勻質(zhì)1 h。6 000 r/min離心30 min，棄沉淀，取上清，得到以上各物種骨骼肌提取物，即為相應(yīng)骨骼肌肌鈣蛋白檢測原，用超微量核酸蛋白測定儀測定溶液蛋白質(zhì)量濃度，于-20 ℃或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

配制12%分離膠、5%濃縮膠，對檢測原進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.3.3 動物免疫

用生理鹽水將豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原稀釋至0.2 mg/mL，取600 μL稀釋的免疫原溶液與等體積弗氏佐劑混合振蕩10 min，首次免疫選用弗氏完全佐劑，之后免疫選用弗氏不完全佐劑。取BALB/c小鼠3 只，向其頸背部注射上述含弗氏佐劑的豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原，注射劑量400 μL/只，共免疫4 次，每隔2 周免疫1 次，最后一次免疫10 d后斷尾取血，間接ELISA方法檢測血清抗體效價，選取效價最高的小鼠進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 豬骨骼肌肌鈣蛋白單克隆抗體的制備

參考文獻(xiàn)[27]的方法，采用PEG法進(jìn)行細(xì)胞融合，融合7 d后出現(xiàn)細(xì)胞集落，更換HT培養(yǎng)基。用間接ELISA方法檢測細(xì)胞上清，篩選分泌單克隆抗體為陽性的孔，通過有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞亞克隆，得到抗體分泌穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株。取1 只BALB/c小鼠進(jìn)行致敏，向其腹腔內(nèi)注射500 μL石蠟油，致敏14 d后，向其腹腔注射入雜交瘤細(xì)胞，12 d后待腹部膨大取腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化，得到單克隆抗體，檢測抗體質(zhì)量濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 豬骨骼肌肌鈣蛋白單克隆抗體特征評價

1.3.5.1 單克隆抗體效價測定

采用間接ELISA方法進(jìn)行單克隆抗體效價的測定[27]。

用含0.015 mol/L Na2CO3、0.035 mol/L NaHCO3的碳酸鹽緩沖液將檢測原質(zhì)量濃度稀釋至2 μg/mL，加入96 孔板，每孔100 μL，37 ℃包被1 h;用含0.1%吐溫-20的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，每孔洗滌3次，拍干;用含0.1%吐溫-20的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液將單克隆抗體以1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800、1∶409 600、1∶819 200做倍比稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃孵育45 min，洗滌，拍干;每孔加入100 μL山羊抗小鼠IgG二抗（稀釋比例1∶10 000），37 ℃孵育30 min，洗滌，拍干;每孔加入100 μL顯色液，37 ℃避光反應(yīng)12 min;每孔加入50 μL終止液，于450 nm波長處測定光密度（optical density，OD）值。陰性對照孔（0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液）記為OD0，各實(shí)驗(yàn)孔記為ODt，以O(shè)Dt/OD0≥2.1所對應(yīng)的稀釋比作為效價檢測結(jié)果。

1.3.5.2 單克隆抗體亞型測定

按照Ig亞型檢測試劑盒的說明書步驟進(jìn)行測定。

1.3.5.3 單克隆抗體特異性測定

用間接ELISA方法測定單克隆抗體與牛、羊、雞、鴨骨骼肌提取物的效價[27]。

用免疫印跡方法檢測單克隆抗體與豬、牛、羊、雞、鴨骨骼肌提取物結(jié)合的特異性。取1.3.2節(jié)制備的豬、牛、羊、雞、鴨檢測原各15 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，切膠，92 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜1 h，封閉，洗膜，用封閉液（含5 g/100 mL牛血清白蛋白、0.05%吐溫-20、0.8 g/100 mL NaCl、0.01 mol/L的Tris緩沖液）將單克隆抗體溶液按體積比1∶2 000稀釋，37 ℃搖動孵育1～1.5 h，洗膜，再用上述封閉液將山羊抗小鼠IgG二抗按1∶3 000稀釋，37 ℃搖動孵育1～1.5 h，洗膜后滴加顯色液，拍照。

1.3.5.4 單克隆抗體親和力測定

采用間接ELISA方法[27]，將豬骨骼肌肌鈣蛋白檢測原按質(zhì)量濃度梯度（1、0.5、0.25、0.125 μg/mL）進(jìn)行包被;對每個檢測原質(zhì)量濃度下，均用含0.1%吐溫-20的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液將單克隆抗體按照1∶10、1∶30、1∶90、1∶270、1∶810、1∶2 430、1∶7 290、1∶21 870、1∶65 610、1∶196 830、1∶590 490、1∶1 771 470、1∶5 314 410、1∶15 943 230和1∶47 829 690做倍比稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃孵育45 min，洗滌，拍干;每孔加入100 μL山羊抗小鼠IgG二抗（稀釋比例1∶10 000），37 ℃孵育30 min，洗滌，拍干;每孔加入100 μL顯色液，37 ℃避光反應(yīng)12 min;每孔加入50 μL終止液，于450 nm波長處測定OD值。以抗體濃度的對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)OD值作為縱坐標(biāo)，繪制曲線。根據(jù)下式計(jì)算親和力常數(shù)。

式中：Ab和Ab分別表示抗原稀釋中2 個不同豬骨骼肌肌鈣蛋白檢測原質(zhì)量濃度下OD=1/2ODmax時分別對應(yīng)的抗體濃度;n表示對應(yīng)豬骨骼肌肌鈣蛋白檢測原質(zhì)量濃度間的稀釋倍數(shù)。4 個質(zhì)量濃度下分別計(jì)算Ka后，結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件、GraphPad Prism 8作圖軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬、牛、羊、雞、鴨骨骼肌免疫原及檢測原的提取結(jié)果

由表1可知，分別取豬、牛、羊、雞、鴨骨骼肌肌肉組織，豬骨骼肌提取后得到蛋白提取物中免疫原及檢測原質(zhì)量濃度分別為5.4 mg/mL和9.0 mg/mL，得率分別為0.28%和2.24%。牛、羊、雞、鴨骨骼肌檢測原蛋白質(zhì)量濃度分別為8.4、12.0、17.8、15.5 mg/mL，得率分別為2.09%、2.32%、3.63%和3.30%。

2.2 豬、牛、羊、雞、鴨骨骼肌免疫原及檢測原的SDS-PAGE結(jié)果

由圖1可知，5 種動物的骨骼肌肌鈣蛋白提取后，蛋白條帶清晰且顏色較深的共有條帶主要有2 條。在37 kDa（sTn T）和24 kDa（sTn I）處，豬免疫原及豬、牛、羊、雞、鴨檢測原均有清晰條帶，其中豬免疫原條帶最為明顯，但24 kDa處不及37 kDa處明顯，牛、羊、豬檢測原在24 kDa處條帶較淺。此外，在18 kDa處（sTn C）牛、羊檢測原有較清晰條帶，其余檢測原沒有;雞檢測原在15 kDa處有1 條特異條帶，鴨檢測原在16 kDa處有1 條特異條帶。以上結(jié)果表明，在蛋白提取過程中不同肌鈣蛋白亞型在不同物種中的損失程度不同。

泳道1. 豬免疫原;泳道2. 豬檢測原;泳道3. 雞檢測原;泳道4. 鴨檢測原;泳道5. 羊檢測原;泳道6. 牛檢測原。

2.3 單克隆抗體效價測定結(jié)果

融合7 d后，用間接ELISA方法檢測細(xì)胞上清，篩選出抗體分泌為陽性的孔，經(jīng)過3～4 次亞克隆至全陽，得到1 株單克隆抗體細(xì)胞株，命名為2E8。由表2可知，單克隆抗體2E8經(jīng)純化后，測得其蛋白質(zhì)量濃度為6.2 mg/mL;包被豬檢測原質(zhì)量濃度2 μg/mL時，其效價為1∶4.1×105。

2.4 單克隆抗體2E8亞型測定結(jié)果

由圖2可知，2E8與IgG2a反應(yīng)的A450 nm為2.49，與其他亞類抗體反應(yīng)的A450 nm均很低，因此，細(xì)胞株2E8分泌的抗體亞型為IgG2a。

2.5 單克隆抗體2E8特異性測定結(jié)果

2.5.1 間接ELISA法檢測結(jié)果

由圖3可知，單克隆抗體2E8與豬檢測原反應(yīng)的效價為1∶4.1×105，與雞、鴨檢測原反應(yīng)的效價均為1∶1.0×105，交叉反應(yīng)率為25%;與牛、羊檢測原反應(yīng)的效價較低，分別為1∶6.4×103、1∶2.6×104，交叉反應(yīng)率分別為1.7%、6.3%。以上結(jié)果表明，單克隆抗體2E8可以在一定程度上區(qū)分豬骨骼肌提取物與牛、羊、雞、鴨的骨骼肌提取物。

2.5.2 免疫印記檢測結(jié)果

泳道1. 鴨免疫原;泳道2. 雞檢測原;泳道3. 羊檢測原;泳道4. 牛檢測原;泳道5. 豬檢測原。

由圖4可知，免疫印跡結(jié)果顯示，在37 kDa（sTn T）處，單克隆抗體2E8與豬檢測原反應(yīng)明顯，條帶清晰，與羊、雞、鴨檢測原反應(yīng)輕微，與牛檢測原幾乎不反應(yīng)。這說明單克隆抗體2E8可以特異性結(jié)合豬骨骼肌肌鈣蛋白T亞基（sTn T），與羊、雞、鴨骨骼肌肌鈣蛋白T有輕微交叉反應(yīng)，與牛骨骼肌肌鈣蛋白T無交叉反應(yīng)。

間接ELISA與免疫印跡的分析結(jié)果均表明，單克隆抗體2E8雖然能在一定程度上區(qū)分豬骨骼肌提取物與牛、羊、雞、鴨的骨骼肌提取物，但與牛、羊、雞、鴨的骨骼肌提取物均存在一定的交叉反應(yīng)。這與豬、牛、羊、雞、鴨的骨骼肌肌鈣蛋白的氨基酸序列具有高相似性有關(guān)。

2.6 單克隆抗體親和力常數(shù)

采用間接ELISA法測定4 種包被質(zhì)量濃度下的抗原與倍比稀釋的抗體反應(yīng)的OD值，繪制單克隆抗體2E8的親和力曲線。通過GraphPad Prism 8軟件計(jì)算OD=1/2ODmax時對應(yīng)的抗體物質(zhì)的量濃度，4 個質(zhì)量濃度下分別計(jì)算Ka后，取平均值，最終獲得單克隆抗體2E8的親和力常數(shù)

Ka=5.14×106 L/mol。

3 結(jié) 論

采用2 種骨骼肌肌鈣蛋白提取的方式，分別提取豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原與豬、牛、羊、雞、鴨骨骼肌肌鈣蛋白檢測原，選擇免疫效果好的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，3 次亞克隆后最終篩選獲得抗豬骨骼肌肌鈣蛋白的抗體1 株，命名為2E8。通過間接ELISA方法對抗體的特征進(jìn)行評價。結(jié)果表明，單克隆抗體2E8為IgG2a亞型;與牛、羊、雞、鴨的交叉反應(yīng)率分別為1.7%、6.3%、25%、25%;親和力常數(shù)為5.14×106 L/mol;免疫印記結(jié)果顯示抗體2E8能夠結(jié)合豬骨骼肌肌鈣蛋白T亞基。以上結(jié)果表明單克隆抗體2E8可以在一定程度上區(qū)分豬、牛、羊、雞、鴨的骨骼肌蛋白提取物，為肉類摻假快速檢測技術(shù)的發(fā)展提供理論與技術(shù)支持。

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