縫隙連接蛋白43在氧誘導視網膜病變小鼠視網膜中的動態表達及意義

王昕，劉向玲，蘇紹波

(1.新鄉醫學院第三臨床學院 眼科，河南 新鄉 453003；2.新鄉醫學院，河南 新鄉 453003)

視網膜新生血管增殖是早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)[1]、糖尿病視網膜病變[2]、新生血管性青光眼[3]等多種眼部血管性疾病發生發展的基礎。氧誘導視網膜病變(oxygen-induced retinopathy，OIR)小鼠模型是研究視網膜新生血管形成及其轉歸最為常用的一種動物模型?？p隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)是連接蛋白家族中表達最廣泛的亞型，在各種疾病動物模型中研究較多[4-7]。但目前尚無OIR小鼠視網膜Cx43表達變化的相關研究報道。本研究的主要目的是了解高氧誘導的OIR小鼠視網膜中Cx43在不同時期的表達水平，探討Cx43與視網膜新生血管形成的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器山羊抗兔二抗(谷歌生物科技有限公司)；Cx43抗體、GAPDH抗體(英國Abcam公司)；Isolectin B4-594(Molecular Probes)；智能控氧儀(杭州艾普儀器設備有限公司)；Tanon發光成像儀(上海天能科技有限公司)；手術顯微鏡(日本尼康公司)；共聚焦顯微鏡(上海仁科生物有限公司)。

1.2 實驗動物分組及取材選用北京維通利華實驗動物技術有限公司提供的7 d齡C57BL/6N小鼠(批號SCXK2016-0006)80只，雌雄不限，體質量2.0～3.0 g，采用隨機數表法將小鼠分為OIR組(40只)和正常對照組(40只)。OIR組小鼠用于建立OIR模型，對照組小鼠在正常空氣環境下飼養，室溫控制在(23±2)℃，同時每3 d更換1次墊料，保持氧艙干燥。分別于12 d齡(P12)、14 d齡(P14)、17 d齡(P17)和21 d齡(P21)隨機抽取兩組小鼠各10只(20眼)，CO2法處死并摘除眼球。3只(6眼)進行視網膜鋪片觀察視網膜新生血管增殖情況；剩余7只小鼠(14眼)取視網膜組織做Western blot，分析Cx43表達水平的變化。

1.3 OIR模型的建立OIR模型是按照Smith等[8]的描述制作的，即將哺乳母鼠與7 d齡C57BL/6N乳鼠放置于氧氣體積分數為(75±2)%的氧箱中，隔日中午定時打開氧艙換食加水，并將正常環境飼養的哺乳母鼠與艙內母鼠進行互換。5 d后(即12 d齡)，小鼠突然回到室內正?？諝猸h境中，建立小鼠OIR模型。

1.4 視網膜鋪片將OIR組及正常對照組小鼠視網膜以視盤為中心剪為四葉草形狀，將剪好的小鼠視網膜轉移至事先配制好的IB4染液中，4 ℃搖床過夜。PBS清洗視網膜3次，每次10 min，再將視網膜轉移至事先準備好的載玻片上，神經節細胞層朝上。滴一滴封片劑于視網膜上，蓋上蓋玻片，放置陰涼處數天后在共聚焦顯微鏡下觀察血管分布及形態變化。

1.5 Western blot將剝離的小鼠視網膜組織放入RIPA蛋白裂解液中，冰上研磨、超聲波破碎，然后轉移至合適EP管，搖床晃動30 min。離心(12 000 r·min-1，4 ℃)10 min，留取上清，BCA法測定蛋白濃度，制樣。將樣品放入100 ℃金屬浴中加熱10 min后進行電泳，恒定電壓80 V，約90 min；電泳完成后進行轉膜(300 mA、90 min)，轉膜時注意不要有氣泡；將轉好的PVDF膜放入含有50 g·L-1脫脂奶粉的TBST溶液，室溫下輕搖封閉2 h；取出PVDF膜，分別加入抗Cx43多克隆抗體(1∶5 000稀釋)與抗GAPDH單克隆抗體(1∶20 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。回收一抗孵育液，TBST溶液洗膜后加入山羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h。棄去二抗，TBST洗膜3次，每次10 min；使用Tanon成像系統顯色并采集圖像分析灰度值。

2 結果

2.1 視網膜鋪片正常對照組：視網膜血管以視盤為中心放射狀分布，呈均勻的網狀結構，血管形態正常，走形清晰，見圖1。OIR組：P12時視網膜中央可見大面積的血管閉塞區，毛細血管分布于視網膜周邊，在血管閉塞區周圍未見到新生血管簇；P14時血管閉塞區周圍出現少量新生血管簇；P17時新生血管增殖達到高峰，可觀察到大量新生血管簇，血管走形迂曲；P21時新生血管部分消退，新生血管簇縮小。見圖2。

2.2 Western blotWestern blot檢測結果表明，正常對照組和OIR組小鼠視網膜組織中均可見Cx43的表達，兩組小鼠不同時間點Cx43的相對表達量。見表1。正常對照組和OIR組各時間點Cx43的表達量差異有統計學意義(F=486.815，P<0.001)，其中正常對照組P12 Cx43的表達量最高，與其他各時間點比較，差異有統計學意義(P<0.05)；OIR組P17 Cx43的表達量最高，與其他各時間點比較，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組P12、P14、P17各時間點Cx43的表達量與OIR組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組P21時Cx43的表達量與OIR組相比差異無統計學意義(P>0.05)。正常對照組Cx43的表達呈逐漸下降的趨勢；OIR組Cx43的表達在出氧艙后先下降再上升，P17后又逐漸下降。見圖3、4、5及表1。

圖3 兩組小鼠視網膜組織Cx43表達情況

白色箭頭示新生血管簇；A為P12；B為P14；C為P17；D為P21。

A為P12；B為P14；C為P17；D為P21。

表1 正常對照組與OIR組在各時間點Cx43/GAPDH灰度值的比較

圖4 對照組Cx43的動態表達(P<0.000 1)

圖5 OIR組Cx43的動態表達(P<0.000 1)

3 討論

3.1 視網膜新生血管的動態變化隨著早產兒存活率的提高，ROP的發病率也呈上升趨勢。研究表明我國體質量<2 kg或胎齡<34周的早產兒，或者因疾病接受氧療超過5 d的新生兒中，ROP發生率為15.2%[9]。從臨床角度看，ROP被認為是一種血管疾病，分2個階段發展。當早產兒暴露在支持其未成熟呼吸系統所需的高水平氧氣中時，控制視網膜血管成熟的正常過程被中斷，導致外圍視網膜無血管。當新生兒在后期回到正?？諝庵袝r，視網膜缺氧在外周無血管視網膜中發展，導致大量新生血管形成，容易發生出血、滲出等，嚴重者可引起視網膜脫離，視力喪失[10]。OIR小鼠模型是研究視網膜新生血管形成及轉歸最經典的動物模型,目前已經被廣泛用于研究ROP發病機制的各個方面。當新生小鼠暴露在體積分數過高的氧氣環境下時，從脈絡膜循環中滲透入視網膜的氧增加，這會導致視網膜血管的生成減少以適應高氧供，當這種高氧供停止、新生小鼠返回正常氧供的空氣環境時，就會造成視網膜相對性的缺氧，因此，一系列細胞因子會被釋放出來介導異常的視網膜新生血管生成[11-12]。

Cx43是連接蛋白亞型中分布最廣、研究最多的一種亞型[13]，在視網膜生理結構及功能上發揮著重要的作用。Cx43不僅對視網膜細胞的新陳代謝、增殖、分化和內環境的穩定等生理過程發揮重要的作用，而且能夠協調視網膜組織的信息傳遞、物質交換、細胞代謝，除此之外，縫隙連接還參與細胞的分化及生長發育[14]。有研究表明，縫隙連接在眼胚胎的發育中，早期可以控制視網膜神經的發育，在成年后，Cx43參與視網膜的再生[15-16]。目前，Cx43已經在大鼠視網膜缺血再灌注模型[4]、光損傷的白化大鼠視網膜變性模型[5]以及其他中樞神經系統模型[6,17]等多種疾病動物模型中得到了廣泛研究。

本研究顯示，正常對照組P12、P14、P17、P21各個日齡視網膜鋪片均未見視網膜新生血管，即正常情況下隨著視網膜的發育無血管異常增殖。OIR組視網膜鋪片顯示P12時即高氧結束尚未進入相對低氧期時視網膜中央可見大面積的血管閉塞區，未見到病理性血管增殖；進入相對低氧階段后，P14時血管閉塞區周圍出現少量新生血管簇；P17時可觀察到大量新生血管簇；P21時新生血管部分消退，新生血管簇縮小。由此也可以看到在相對低氧狀態下，視網膜新生血管逐漸發生，P17達高峰，以后又逐漸減少的過程。這一結果與Smith等[8]的研究相一致，證明OIR小鼠模型制造成功，可以用于以后的實驗。

3.2 OIR模型Cx43的動態表達OIR小鼠模型中視網膜新生血管的形成是一個漸進的過程，這個過程可以簡單地概括為：增殖、出芽、形成、重塑4個階段[18]。本實驗選擇在OIR病理Ⅱ期即視網膜新生血管增殖期的不同時期檢測Cx43的表達，可以得到Cx43在新生血管從發生發展到消退整個時期的表達數據，對于后續的實驗研究意義重大。

本研究結果顯示，正常對照組和OIR組各時間點Cx43的表達量差異有統計學意義，其中正常對照組P12 Cx43的表達量最高，OIR組P17 Cx43的表達量最高，與組內其他各時間點比較，差異有統計學意義。P12、P14、P17各時間點Cx43的表達量正常對照組與OIR組相比，差異有統計學意義。同時觀察到正常對照組Cx43的表達呈逐漸下降的趨勢，OIR組Cx43的表達在出氧艙后先下降再上升，P17后又逐漸下降。

本研究認為Cx43可能參與視網膜新生血管的形成以及發生發展，在正常情況下連接蛋白表達的增加意味著在細胞膜中將有更多數量的非對立半通道，與此同時，這些通道顯示出增加的開放概率，雖然這也可能為細胞內和細胞外環境之間的自分泌和旁分泌以及信號轉導提供了一條途徑，但是，開放的半通道將構成一個大的、相對非特異性的膜通道，這會導致內皮細胞腫脹、破裂，血管完整性喪失[19]。本研究在正常對照組觀察到Cx43的表達在P12達高峰且呈逐漸下降的趨勢，也證實了這個觀點。小鼠處于高氧環境中時，正常血管閉塞，當小鼠回到室內空氣中時，由于極度缺氧，病理性新生血管逐漸形成，在視網膜鋪片中觀察到視網膜新生血管在P17時達到高峰，與此同時，Cx43表達量在P17時也達到高峰，且高于正常對照組以及OIR組P12、P14時；在P21視網膜鋪片中觀察到新生血管的部分消退，而Cx43表達在此時也較P17時下降，且和正常對照組相比無明顯差異，說明Cx43在視網膜新生血管的發生發展中起到了非常重要的作用。

綜上所述，本研究首次從Cx43在OIR模型小鼠視網膜病變中的動態表達方面，證實了Cx43在視網膜新生血管發生發展中的作用，表明Cx43可能促進OIR小鼠視網膜病理性新生血管的形成以及發生發展。對于Cx43調節劑的研究可能為臨床ROP的藥物研發提供了一種新思路，而Cx43影響病理性新生血管形成的分子機制，尚有待進一步研究。