凝結芽孢桿菌BC66對團頭魴臟器組織形態及血清生化指標的影響

向 陽， 胡 鯤*， 方曙光， 朱建國， 柯 軻， 陳 獻

（1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海201306；2.上海海洋大學國家水生動物病原庫，上海201306；3.上海海洋大學農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306；4.微康益生菌（蘇州）股份有限公司，江蘇蘇州215200；5.蘇州宏鰲生物農業發展有限公司，江蘇蘇州215200）

隨著水產養殖規模、集約化程度不斷提高，水產動物病害問題也日趨嚴重。據統計，2019年我國因病害造成的水產品損失高達408億元（崔利鋒，2020）。加之抗生素耐藥性和化學藥物污染等問題日益凸顯（李炳等，2020；Wu等，2019），利用益生菌防治水產動物疾病、減少經濟損失已然成為水產養殖從業人員和研究學者關注的焦點。益生菌可通過定植在水產動物腸道，改善其腸道微生態環境，優化腸道菌群，從而發揮其有效作用（張美玲等，2021）。目前，芽孢桿菌類的益生菌在促進水產動物生長、增強機體免疫以及改良水質等方面的研究已取得良好進展（吳豪益等，2021）。

凝結芽孢桿菌是一類既具有產乳酸特性，又同其他芽孢桿菌一樣具有耐高溫特性，兼性厭氧的革蘭氏陽性菌（鄒梅等，2017）。自2013年被正式列入《飼料添加劑品種目錄》以來，凝結芽孢桿菌已作為益生菌廣泛應用于畜禽水產等行業，飼料中添加凝結芽孢桿菌可提高飼料養分的利用率（Fu等，2021），促進其蛋白質和脂類代謝流轉（吳正可，2021），提高生長性能和機體抗病力（李佳徽，2021），改善腸道菌群結構。基于此，本研究在團頭魴飼糧中添加凝結芽孢桿菌，觀察對其臟器組織形態和血清生化指標的影響，為凝結芽孢桿菌等益生菌在水產養殖上的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 凝結芽孢桿菌制劑BC66（1000 cfu/g）由微康益生菌（蘇州）股份有限公司提供，于2020年7～8月在江蘇無錫開展。

1.2 試驗設計 試驗選取體重（26.5±0.5）g的健康團頭魴幼苗180尾，隨機分為2組，每組3個重復，每個重復30尾。對照組投喂基礎日糧（表1），試驗組為基礎日糧+0.15‰的凝結芽孢桿菌BC66制劑，試驗30 d。試驗期間以重復為單位，每天投喂3次。試驗期水溫控制在26～30℃，pH為7.0～8.0，溶氧保持在5 mg/L以上。

表1 基礎日糧組成及營養水平

1.3 試驗方法 解剖取樣觀察：于試驗初期、末期分別在每個重復選3尾魚解剖，對比觀察腹腔及腸道狀況，并取完整腸道、腎臟和肝胰臟樣本。

將樣本用0.65%的生理鹽水沖洗腸道內容物，取1～2 cm的前腸和后腸，以10%的甲醛溶液固定備用。另外，再在每個重復分別取3尾，尾靜脈取血6 mL，均分為2等份。一份放入抗凝管中，進行血液常規參數測定；另一份血液于8000 r/min、4℃的條件下離心5 min，制備得到的血清于-20℃凍存備用，用于測定血清生化指標。

組織病理切片觀察：各組樣本經10%甲醛溶液固定24 h后，水洗20 min，再用梯度酒精脫水。脫水后的組織用二甲苯處理至完全透明后，用石蠟浸泡包埋、切片，厚度設置為4～5μm。經HE染色后，用中性樹膠封片，在100×10倍光學顯微鏡下觀察。

血液常規參數：采用全自動動物血液細胞分析儀（邁瑞BC-5300VEt）測定血紅蛋白濃度（HGB）和紅細胞（RBC）、白細胞（WBC）等，所用試劑購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

血清生化指標：采用分析試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）測定谷氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、總 蛋 白（TP）、白 蛋 白（ALP）、尿 素 氨（BUN）等指標，詳細操作根據試劑盒說明書進行。

2 結果與分析

2.1 凝結芽孢桿菌BC66對團頭魴臟器組織形態的影響 試驗結果表明，試驗組投喂凝結芽孢桿菌后，腹腔充血狀況極大改善，腸道壁毛細血管充血現象消失，韌性增強。試驗末期試驗組腹腔顏色自然，腹腔充血狀況消失，腸道韌性強。

進一步對各臟器組織病理切片（100×10）進行對比發現（圖1～4，A為對照組，B為試驗組），試驗組前、后腸道組織更緊密，腸上皮細胞溶解現象明顯減少。投喂凝結芽孢桿菌的試驗組團頭魴肝臟、腎臟組織緊密性增強，分布更為均勻，體現出更好的代謝及排泄功能。

圖1 前腸組織切片（100＊10）

2.2 凝結芽孢桿菌BC66對團頭魴血液常規指標的影響 如表2所示，日糧添加凝結芽孢桿菌BC66后，血紅蛋白濃度較試驗初期提升了20.6%，較末期對照組提升了12.3%。紅細胞數量較試驗初期降低了31.3%，比末期對照組高出36.1%。白細胞數量較試驗初期提升了41.1%，比末期對照組高出11.5%。

表2 凝結芽孢桿菌BC66對團頭魴血常規指標的影響

2.3 凝結芽孢桿菌BC66對團頭魴血清生化指標的影響 如表3所示，飼喂凝結芽孢桿菌后，總蛋白、白蛋白含量較試驗初期分別提升了32.6%、26.0%，尿素氮指標較試驗初期降低了28.8%。谷氨酸氨基轉移酶和天門冬氨酸氨基轉移酶較試驗初期分別降低了8.4%、15.0%，堿性磷酸酶指標試驗前后基本無變化。

表3 凝結芽孢桿菌對團頭魴血清生化指標的影響

圖3 肝臟組織切片（100×10）

圖4 腎臟組織切片（100×10）

3 討論

腸道、肝臟和腎臟分別是動物進行消化、代謝和排泄的主要場所，各組織的形態結構與其生理功能聯系緊密。申維維、蔣磊等（2021）研究證實，飼料中添加凝結芽孢桿菌可改善肉雞腸道形態結構，起到促進生長的作用。在水產養殖應用中，關于凝結芽孢桿菌改善魚類腸道結構的報道較少見，大多集中在凝結芽孢桿菌對腸道菌群的影響（匡群等，2013）。單金峰等（2019）研究發現，凝結芽孢桿菌可顯著增加青蝦腸道微生物區系。凝結芽孢桿菌可降低虹鱒腸道變形菌門比例，提升厚壁菌門、擬桿菌門比例。反映出凝結芽孢桿菌在改善水產動物腸道微生物屏障方面有促進作用。正常的腸道微生物屏障對腸絨毛形態結構的維持具有重要作用，可通過排擠有害菌，分泌抑菌素，減少腸上皮損傷。本研究飼喂凝結芽孢桿菌后解剖觀察發現，團頭魴腹腔充血狀況極大改善，腸道壁毛細血管充血現象消失，韌性增強。腸道組織也更緊密平滑、分布規則，上皮細胞無溶解現象，顯示出改善腸道絨毛結構的效果。說明凝結芽孢桿菌在改善腸道表型形態、維護腸道健康方面具有促進作用。

金子博（2018）和付天璽等（2008）研究發現，凝結芽孢桿菌可顯著提高魚體肝胰臟消化酶活性。本研究雖未測定各消化酶活性，但從肝臟、腎臟組織切片可看出，試驗組團頭魴肝臟、腎臟組織緊密性增強，分布均勻，腺體更加明顯，間接顯示出凝結芽孢桿菌能在一定程度上提高肝臟的消化代謝和排泄水平。

血液中白細胞數量與魚體的健康狀況息息相關，本研究中飼喂凝結芽孢桿菌后，團頭魴血液白細胞數量明顯上升，末期水平仍高出對照組，說明凝結芽孢桿菌對提高機體免疫力具有一定的作用。但試驗組血紅蛋白濃度和紅細胞數量指標變化明顯，這與張維娜等（2015）的研究結果類似，是否與凝結芽孢桿菌使用劑量有關還有待研究。血清總蛋白主要由血清球蛋白和血清白蛋白構成，試驗組投喂后總蛋白含量稍有上升，白蛋白含量降低，表明凝結芽孢桿菌對血清球蛋白的生成具有促進作用。谷氨酸氨基轉移酶和天門冬氨酸氨基轉移酶是衡量肝功能的重要指標。本研究中谷氨酸氨基轉移酶和天門冬氨酸氨基轉移酶活性較投喂前降低，與張維娜等（2015）的0.3%凝結芽孢桿菌試驗組結果類似，進一步證實凝結芽孢桿菌對肝功能起到了一定的促進作用。尿素氮是動物體內蛋白代謝的主要產物之一，投喂凝結芽孢桿菌后試驗組尿素氮含量降低，且低于對照組，說明凝結芽孢桿菌能提高團頭魴蛋白利用率，這與吳正可等（2021）的研究結果一致。堿性磷酸酶為生物體內普遍存在并參與生命活動的一種代謝調控酶，本研究試驗組堿性磷酸酶活性略有降低，與張維娜等（2015）凝結芽孢桿菌試驗組結果類似，但與趙祖艷等（2021）的研究結果相反。這可能與飼料中添加凝結芽孢桿菌的劑量有關。

4 結論

日糧中添加107cfu/g凝結芽孢桿菌BC66可改善團頭魴腹腔充血狀況，可增強腸道韌性，提升肝、腎的組織形態，有助于消化代謝和排泄水平提升；可提高血液白細胞總數，促進免疫功能；可降低血清谷氨酸氨基轉移酶和天門冬氨酸氨基轉移酶水平，有助于維持肝臟正常功能。