抗HBV天然化合物作用機制的研究進展

相佳瑤，許 敏，馮 陽

(昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)為嗜肝DNA病毒，HBV感染會引發乙型病毒性肝炎，如果缺乏及時有效的治療，會導致肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)等嚴重后果，甚至危及患者生命[1]。盡管疫苗能有效預防HBV的感染，但是疫苗對已經感染HBV的患者無效。目前仍存在大量HBV感染患者，據世界衛生組織估計，全世界約有2.57億人為慢性乙肝病毒感染者[2]。現在臨床上使用的抗HBV藥物主要有干擾素(interferon，IFN)與核苷(酸)類藥物兩大類，分別通過調節免疫和干擾乙肝病毒的復制過程來發揮作用，但是核苷(酸)類藥物產生的耐藥性問題和IFN的副作用一直是當前治療HBV的局限所在，臨床仍缺乏能治愈HBV感染的有效藥物。因此，繼續研究和開發新穎且有效的抗HBV藥物，尋找干預HBV感染和復制的新靶點和新方法仍是非常有必要也非常有意義的研究工作。

天然化合物因其結構的多樣性和復雜性是發現新藥或新的藥物先導分子的重要源泉[3]。中國傳統醫學記載了將一些中草藥用于乙型病毒性肝炎的治療[4-6]；在現代藥學的相關研究中，有很多研究報道了天然化合物具有抑制HBV活性，并對其作用機制進行了深入研究。本文從天然化合物調控HBV自身因子和調控宿主相關因子兩方面，對近年來關于天然化合物抗HBV作用機制研究的情況進行總結，以期為抗HBV新藥的研發提供一定的參考。

1 HBV的形態及感染過程

HBV屬于嗜肝DNA病毒科(hepadnavividae)，是一種DNA包膜病毒，基因組為3.2 kb的部分雙鏈環狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)。其感染宿主的過程大概為：HBV與細胞表面受體結合后進入細胞，在核孔處核衣殼分解釋放出rcDNA進入宿主細胞核；在DNA聚合酶等的作用下[7]，rcDNA的缺口被補齊，形成共價閉合環狀DNA (eovalently closed circular DNA，cccDNA)。隨后，宿主細胞內的RNA聚合酶II以cccDNA為模板轉錄出4種mRNA，其中最長的轉錄物為前基因組RNA(pgRNA)，除了作為翻譯的模板外，還作為病毒反轉錄模板合成新的rcDNA。新形成的rcDNA與核心蛋白形成成熟的核心顆粒，再裹上包膜蛋白成為成熟的病毒顆粒分泌到細胞外。另外一小部分核心顆粒脫去核衣殼回到細胞核，再次轉化為cccDNA儲存在肝細胞核中[8]。

概括來說，HBV的生命周期主要包括感染、脫殼、轉錄復制、裝配和釋放(Fig1)。從理論上講，上述病毒周期的每個步驟均可作為抗肝炎藥物篩選的靶標。然而，由于HBV的獨特性，直接作用于HBV生命周期的分子總會被耐藥性和毒性困擾。隨著分子生物學的發展，發現了間接干擾HBV生命周期的靶點或是誘導宿主積極應對的機制[9-13]。例如，鈉離子-牛磺膽酸共轉運多肽(NTCP)，HBV衣殼蛋白的裝配(核心蛋白二聚化基序及裝配結構域的N-端149個氨基酸殘基沒有人體蛋白質同源序列)，HBV生命周期息息相關的宿主蛋白Hsp70，與機體免疫相關的Toll-like受體等，為抗HBV提供了新的靶點。

Fig 1 The hepatitis B virus life cycle and therapeutic interventions

2 天然化合物抗HBV作用機制研究進展

自然界中天然產物的結構豐富，生物多樣性豐富。迄今為止，發現了許多的抗HBV活性的天然分子，骨架類型涉及萜類、木脂素類、生物堿類、酚酸類和黃酮類等[14]。但是，開展了系統作用機制研究的天然分子不多，也未見綜述系統討論天然分子抗HBV作用機制的研究進展。因此，本文將從靶向HBV自身生命周期和宿主細胞相關蛋白兩方面，總結天然產物抗HBV的活性和作用機制。

2.1 通過調節HBV自身的生命周期而發揮抗HBV活性Huang等[15]從天胡荽(Hydrocotylesibthorpioides)中發現積雪草苷(asiaticoside)能顯著抑制HBsAg、HBeAg、HBV DNA和cccDNA的形成，且呈劑量依賴性。通過對其作用機制的初步探索發現，積雪草苷可能通過抑制C、S和X基因啟動子的活性來影響相應基因的轉錄和病毒的復制。此外，當使用感染乙肝病毒的鴨來評估積雪草苷的抗HBV活性時，發現積雪草苷可以有效抑制DHBV在鴨體內的復制。有趣的是，終止藥物治療3 d后的結果表明，積雪草苷在鴨體內的抗HBV作用在抑制HBV DNA、HBsAg和HBeAg反彈方面比拉米夫定更有效。這一發現表明積雪草苷的長時間活性可能具有重要的臨床意義。

Wang等[16]發現從白首烏(Cynanchumauriculatum)中分離出來的告達亭苷元(caudatin)有抑制HBsAg分泌和HBV DNA復制的活性，在告達亭苷元基礎上做了化學修飾合成了一系列新的化合物，發現化合物3-O-(3,4,5-三甲基)肉桂酰基告達亭苷元(3-O-(3,4,5-trimethoxy)cinnamoyl caudatin)對HBsAg、HBeAg的分泌和HBV DNA復制具有顯著抑制活性，IC50分別為5.52、5.52、2.44 μmol·L-1。初步的機制探索發現，3-O-(3,4,5-三甲基)肉桂酰基告達亭苷元可能是通過干擾HBV X啟動子和增強子I來影響X基因的轉錄從而發揮抗病毒作用。考慮到最小X啟動子序列與增強子I的3'端有大約20個核苷酸重疊，推測3-O-(3,4,5-三甲基)肉桂酰基告達亭苷元同時影響了重疊區域的X啟動子和增強子I。

從臺灣杉中(Taiwaniacryptomerioides)分離出的HE-145(helioxanthin)及其類似物曾被報道能降低HBV DNA和RNA的水平，并且減少了核心蛋白的表達[17-18]。進一步探索HE-145抗HBV的作用機制，利用熒光素酶報告基因系統研究HE-145對4種病毒啟動子活性的影響。結果表明，HE-145選擇性抑制了S基因啟動子II (SPII)和C基因啟動子(CP)，但對S基因啟動子I (SPI)和X基因啟動子(Xp)無影響。在非肝細胞如293T細胞和HeLa細胞中未觀察到HE-145對SPII或CP啟動子的抑制，這表明HE-145對SPII和CP的抑制作用可能是肝特異性的。HBV preC/C啟動子/Enh II區域包含許多轉錄因子結合位點，其中許多順式元件已被證明在病毒基因表達中發揮關鍵作用。電泳遷移率試驗(EMSA)表明，HE-145降低了HepA2 細胞核提取物與CP上幾個順式作用元件的DNA結合活性，包括α-甲胎蛋白轉錄因子結合位點、過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR)結合位點和轉錄因子Sp1結合位點；過表達PPAR和肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha，HNF4α)可緩解HE-145對CP的抑制。這些結果表明，HE-145具有獨特的抗HBV機制，可能成為一類新型的潛在抗HBV藥物。

2.2 通過調節宿主細胞相關因子而發揮抗HBV活性Pang等[19]發現綠茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)能顯著抑制HepG2.2.15細胞分泌HBsAg和HBeAg，并且呈劑量和時間依賴性；同時EGCG還顯著降低了細胞外HBV DNA的表達水平。此外Huang等[20]研究發現EGCG(50 μmol·L-1)能抑制80%以上的HBV進入永生化人原代肝細胞，并能顯著抑制HBV對表達HA-NTCP的Huh7細胞和HuS-E/2細胞的感染。用EGCG處理表達HA-NTCP的Huh7細胞，導致其中HA-NTCP蛋白的表達降低，進一步對細胞膜上的HA-NTCP表達情況進行分析發現，EGCG處理顯著誘導了NTCP從細胞這膜向細胞質的轉運，表明EGCG可能誘發了NTCP的內吞和降解。

Yao等[21]研究發現從白頭翁(Pulsatillachinensis)中提取的樺木酸(betulinicacid，BetA)有抑制HBV DNA復制的作用。在來自HBV轉基因小鼠的肝細胞中，樺木酸通過下調超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 2，SOD2)的表達來顯著抑制HBV的復制，并導致活性氧自由基生成和線粒體功能障礙。進一步的研究發現，BetA是通過使cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)的Ser133去磷酸化來抑制SOD2的表達，因為CREB的Ser133處于磷酸化狀態時才能激活SOD2轉錄。過表達SOD2消除了BetA對HBV復制的抑制作用，而抑制SOD2表達則消除了這種作用，這些結果表明樺木酸介導的HBV清除是由于對線粒體氧化還原平衡的調節。在HBV轉基因小鼠中的研究發現，BetA和白頭翁粗提物均顯著抑制了SOD2的表達、增強了肝組織中活性氧的產生，隨后大量清除了HBV，這為上述關于BetA調節線粒體氧化還原平衡的推論提供了進一步的證據。

Huang等[22]在HepG2.2.15細胞和HBV感染的Huh7細胞中的研究發現，從闊葉山麥冬(Liriopeplatyphylla)根部提取出的化合物3-(4'-羥基芐基)-5,7-二羥基-6-甲基苯并吡喃-4-酮(LPRP-Et-97543)具有潛在的抗HBV活性，對pgRNA和preS/S RNA的表達水平有明顯的抑制，并能顯著降低C、S、preS等基因啟動子活性，但對X基因啟動子無影響。進一步的轉錄調控分析發現，LPRP-Et-97543特異性抑制了NF-κB的啟動子活性，降低了p65/p50的蛋白表達水平，同時增加了NF-κB抑制物IκBα的蛋白水平。NF-κB活性被抑制從而影響了其對HBV相關基因轉錄的激活作用。總的來說，該研究發現LPRP-Et-97543可能通過干擾宿主細胞NF-κB信號通路進而抑制HBV基因表達來發揮抗HBV的作用。

Wu等[23]從六棱菊[Laggeraalata(D.Don)Sch.-BipexOlivier]中分離出的化合物3,4-O-二咖啡酰奎尼酸(3,4-O-dicaffeoylquinic acid)和化合物3,5-O-二咖啡酰奎尼酸(3,5-O-dicaffeoylquinic acid)[24]能顯著抑制HBV HBsAg和HBeAg的生成。在HepG2.2.15細胞和HBV轉基因小鼠中，3,4-O-二咖啡酰奎尼酸和3,5-O-二咖啡酰奎尼酸能顯著降低HBV cccDNA的含量，并顯著誘導血紅素氧合酶-1 (heme oxygenase-1，HO-1)的表達。在肝細胞中，過表達HO-1能顯著降低HBV核心蛋白的穩定性，并在轉錄后階段有效抑制HBV的復制，阻斷細胞核中HBV cccDNA的重新填充，從而導致cccDNA含量減少；運用RNAi技術降低細胞中HO-1基因表達后這種效應被逆轉，這些研究結果表明HO-1確實介導了3,4-O-二咖啡酰奎尼酸和3,5-O-二咖啡酰奎尼酸的抗HBV作用[25]。

天然酚類化合物姜黃素(curcumin)被發現可以抑制HBV基因的表達和復制。Rechtman等[26]研究發現這種抑制作用是通過下調過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator activated receptorγcoactivator-1α，PGC-1α)來介導的。PGC-1α是一種饑餓誘導蛋白，可以啟動糖異生級聯反應，并被證明可以有效地協同激活HBV轉錄。實驗表明姜黃素在蛋白水平影響了PGC-1α，通過促進PGC-1α蛋白的降解來抑制HBV。此外研究還發現姜黃素可以與抗HBV核苷酸/核苷類似物協同工作，增強對HBV基因表達的抑制。姜黃素作為宿主靶向治療HBV感染，可以補充目前的病毒特異性治療。

來自于苦參植物(Sophorajaponica)的氧化苦參堿(oxymatrine，OMTR))在中國用于治療乙型肝炎患者已有數十年，其安全性已得到證實。熱激同源蛋白70(Hsc70)是HBV復制所必須的一種宿主蛋白。研究發現OMTR可通過破壞Hsc70 mRNA的穩定，在轉錄后水平顯著下調宿主Hsc70 mRNA的表達，進而在逆轉錄階段抑制HBV從pgRNA到DNA的從頭合成，從而表現出抗HBV的效果。由于這個靶點不是病毒蛋白，OMTR對野生型HBV或耐逆轉錄酶(RT)抑制劑的菌株都有活性。此外，敲除Hsc70基因的小鼠未顯示異常，該表明抑制Hsc70后安全性良好[27-28]，這也為OMTR進一步作為抗HBV藥物開發提供了一個很好的依據。

鹽酸千金藤堿(Cepharanthine hydrochloride，CH)是一種天然生物堿衍生物。Zhou等[29]研究發現該化合物能以劑量依賴的方式抑制野生型或拉米夫定耐藥型HBV臨床分離株的DNA復制和HBeAg的分泌，這表明該化合物可能是治療拉米夫定耐藥的慢性乙型肝炎患者的一種新的替代藥物。進一步研究發現，CH抑制宿主Hsc70 mRNA表達與抑制細胞內HBV復制的作用是平行的，說明CH可能是通過下調宿主Hsc70表達來抑制HBV的復制。

Huang等[30]發現從青蒿(Artemisiamorrisonensis)中分離得到的化合物對羥基苯乙酮(p-hydroxyacetophenone，PHAP)能顯著抑制HBsAg的分泌和HBV DNA的表達水平。在轉染了HBV的Huh7細胞中，PHAP處理后病毒表面基因的2.4kb preS RNA相對于2.1kb S RNA明顯增加。啟動子活性分析結果表明，PHAP可以增強病毒preS啟動子的活性，HBV的大表面蛋白的表達隨之增加并引發內質網應激(ERS)。PHAP特異性降低了Huh7細胞中內質網應激相關的GRP 78的基因和蛋白水平，同時還導致病毒在細胞內的明顯積累。此外，用毒胡蘿卜素(ER伴侶誘導劑)處理減輕了PHAP對細胞上清液中HBV DNA水平的抑制作用。根據以上結果推測，PHAP的抗HBV機制可能是通過干擾內質網應激信號通路，調控病毒表面基因表達和阻斷病毒粒子分泌。

Tab 1 Summary of mechanism of action of anti-HBV natural products

CompoundStructureSourceMechanismofactionReferencesOMTROMTRdown-regulatestheexpres-sionlevelofHsc70mRNAbyde-stroyingthestabilityofHsc70mR-NA,thusinhibitingthesynthesisofHBVDNA[27-28]CHCHinhibitsthesynthesisofHBVDNAbydown-regulatingexpres-sionofHsc70mRNAinhostcells[29]PHAPArtemisiamorrisonensisPHAPregulatesexpressionofHBVsurfacegeneandinterruptsthese-cretionofvirionsbyinterferingwiththeERS[30]

3 結語

到目前為止，臨床上還沒有有效的藥物或方法可以治愈乙肝病毒感染性疾病。因此，抗乙肝病毒藥物的研發仍然是當務之急。從目前研究發現的天然化合物抗HBV作用機制來看，大部分活性化合物是通過作用于宿主相關因子來抑制病毒在細胞中的復制，或是通過調控病毒S、C和X基因啟動子的活性來調控病毒自身因子而影響病毒的復制。但是發現抗HBV活性化合物直接作用靶點的報道還非常少，而且專注于發現抑制病毒某個生命周期階段的研究也比較缺乏。比如，cccDNA在細胞中的持續存在是HBV形成慢性感染的一個重要原因，如果專注以篩選抑制rcDNA到cccDNA形成階段或者抑制rcDNA的再形成再補充cccDNA的階段的活性化合物為目標，可能會在抗HBV新藥研發方面有新的突破。

綜上所述，關于天然產物抗HBV的新作用機制或新靶點的報道并不多。許多天然產物被報道顯示出顯著的抗HBV作用，但它們僅限于基于細胞或轉基因小鼠的研究，但具體的作用機制并不清楚，靶標蛋白不明確。此外，也有很多文章報道了天然化合物的潛在抗乙肝病毒的活性，但沒有開展構效關系討論或是進一步的結構修飾和改造，很難為后續的靶點和作用機制的系統深入研究提供支撐。因此，非常有必要通過化學生物學等學科交叉的手段，深入系統開展活性天然產物的靶點和作用機制的深入研究，推進天然抗HBV新先導分子的發現或是乙肝病毒新靶點的發現。